ViSNE, SPADE ve FlowSOM gibi algoritmaların gözetimsiz içeriği, önceden tarif edilmemiş fenotipleri keşfetme şansını artırır. viSNE, ilginç ve nadir biyolojik alt kümeleri belirlemenize olanak tanıyan, yüksek parametrik verilerin iki boyutlu bir görünümünü oluşturan bir boyut azaltma ve görselleştirme algoritmasıdır. viSNE genellikle keşifsel veri analizi için bir ilk adım olarak kullanılır ve Cytobank'ta kümeleme algoritmalarına kolayca bağlanabilir ^1. FlowSOM, büyük yüksek boyutlu veri kümelerinin hızlı, sezgisel analizi ve sunumu için yorumlaması kolay bir minimum kapsama ağacında fenotipik olarak benzer hücreleri Cytobank Platformu üzerinde kümeleyen bir Kendi Kendine Organize Olan Harita algoritmasıdır². Kümeleme ve viSNE verilerini bir araya getirmek ve bir viSNE haritasında kümeleme verilerini yerel verilerinizle birlikte görüntülemek kümeleme algoritması optimizasyonu ve küme kimliğinin değerlendirilmesi konusunda yardımcı olabilir. Bir sonraki bölümde, Şekil 1'de özetlendiği gibi gerekli adımların nasıl gerçekleştirileceği konusunda bir kılavuz sağlıyoruz.

CytoFLEX LX üzerinde 20 renkli bir Panelin Yüksek Boyutlu Akış Sitometresi Verisi Örneğinizin Potansiyelini Keşfetmek için Makine Öğrenimi Algoritmalarını Kullanma başlıklı Teknik Notumuzda bir örnek görüntüleyin.

Şekil 1. Cytobank ile Yüksek Boyutlu Akış Sitometresi Veri Analizi Veri Hattı. Biyobelirteç keşif analizi veri hattı için özetlenen temel adımlar. 1) Veri edinimi 2) Veri telafisi, dönüşüm ve kalite kontrolü ve 3) Veri temizleme ve isteğe bağlı bir ön geçitleme 4) ViSNE 5 ile keşif amaçlı veri analizi 5) Kümeleme ve biyobelirteç keşfi, 6) Sonuçları iletmek için görselleştirmeler.

1. Veri edinimi
   Deney kurulumu ve veri edinme süreci sırasında, istatistiksel geçerlilik için gerekli olan örnek boyutunun yanı sıra araştırma sorularınıza bağlı olarak kontrol örneklerini göz önünde bulundurmak önemlidir. Örneklerinizi birden fazla parti şeklinde çalışırsanız, potansiyel parti etkilerinin de değerlendirilmesi ve kontrol edilmesi gerekir


2. Veri dengeleme, dönüşüm ve kalite kontrolü
   Cytobank, makine öğrenimi algoritmalarını kullanarak sonraki analiz için veri hazırlamak üzere araçlar sunar. Alternatif olarak, Kaluza Analysis Software (Kaluza Analysis Yazılımı) ve Kaluza Cytobank plugin (Kaluza Cytobank eklentisi) floresans telafisi ve veri dönüşümü için kullanılabilir.
   
   Telafi:
   Florokromların belirlenmiş saptama kanalı dışındaki kanallara floresans dağılımı floresan telafisi ile düzeltilir. Telafi kalıntıları düzeltilmezse aşağı akış analizini olumsuz etkileyebilir. Örnekler zaten uygulanmış olan telafisi matrisi ile elde edilse dahi, tüm örnekler için telafiyi kontrol etmek ve düzeltmek önerilir.
   
   
   Şekil 2. Sitometre Verilerinin Gelişmiş Makine Öğrenimi Analizinden önce uygun şekilde Telafi Edilmesi gerekir. Kötü (A) ve iyi telafi (B) örneği.
   
   Ölçek dönüşümü:
   Akış sitometresinde, tipik olarak aşağıdaki görüntüleme ölçeklerinden biri kullanılır: lineer, log10, arcsinh veya çift eksponansiyel dönüşüm. Cytobank, çoğu modern dijital sitometre tarafından üretilen veriler için floresan kanallara yönelik ölçek denklemini otomatik olarak arksinh şeklinde ayarlar. Gelişmiş makine öğrenimi algoritmaları, özellikle de ölçek argümanları için ölçekleri doğru şekilde ayarlamak çok önemlidir. Algoritmalar ölçek dışı olup olmadıklarına bakılmaksızın ölçeğinizin tam aralığını okuyacaktır, yani ölçek min ve maks değerleri önemli değildir, ancak ölçek argümanları değeri sonuçları etkileyecektir. Lütfen sitometre verilerinin nasıl ölçeklendirileceğine ilişkin blog yazımıza bakın.
   
   
   Şekil 3. Ölçek Dönüştürme Ayarları. Kötü (A) ve iyi ölçeklere (B) birer örnek. CD4 kanalı, tüm negatif değerlerin sağda gösterildiği gibi bölge etrafında tek bir tepe noktası oluşturması gerektiği sıfır bölgesi etrafında alçalarak solda uygun olmayan şekilde ölçeklendirilmiştir.

Kalite kontrol:
Örnek toplama sürecinin stabilitesi, saçılım ve floresansa karşın zaman verileri görüntülenerek değerlendirilebilir. Veri edinimindeki boşluklar, örnek akışının tıkanıklıklar veya kabarcıklar nedeniyle kesintiye uğradığına işaret edebilir. Bu ekran, kullanıcının örnek akışı ve sinyal saptaması stabil olduğunda analizi edinimin kısımlarıyla kısıtlamasını sağlar.


Şekil 5. Veri Ön İşleme: A) tek hücrelerde geçit ile, B) birikintiden dışarı geçit ile ve C) canlı hücreler üzerinde geçit ile D) CD45+ lökositler veya lenfositler gibi ana alt kümelerde geçitleme isteğe bağlıdır.


3. Veri temizleme ve isteğe bağlı ön geçitleme
   Boşaltma kanalı, birikinti, ikili ve ölü hücreler gibi istenmeyen olayları ön geçitleme yoluyla ortadan kaldırın. Bu olaylar, aşağı doğru akış analizine bilgi eklemez, veri görüntülemesini olumsuz etkileyebilir ve uygun şekilde tanımlanmaz ve hariç bırakılmazsa istatistiksel sonuçları karıştırabilir. İstenen veri görselleştirme ve araştırma sorularına bağlı olarak, daha fazla analiz için ilgilenilen popülasyonu ön geçitlemek faydalı olabilir.
   
   
   Şekil 5. Veri Ön İşleme: A) tek hücrelerde geçit ile, B) birikintiden dışarı geçit ile ve C) canlı hücreler üzerinde geçit ile D) CD45+ lökositler veya lenfositler gibi ana alt kümelerde geçitleme isteğe bağlıdır.


4. ViSNE ile keşif amaçlı veri analizi
Bir viSNE çalışması nasıl kurulur


• Analiz edilecek tüm örneklerin önceden geçitlenmiş popülasyonunu ve dosyalarını seçin. Toplam olay sayısını viSNE için maksimum olay sayısına ayarlayın ve eşit örnekleme seçeneğini seçin.


• viSNE için kullanılacak kümeleme kanallarını seçin. Ön geçitleme sırasında alt kümeleri tanımlamak için kullanılan kanalları hariç tutmalı ve popülasyonları tanımlamak için kullanmak istediğiniz tüm kanalları dahil etmelisiniz. Örneğin zaman parametresini veya floresans kanallarıyla birlikte saçılım kanallarını seçerek kanal seçiminde doğrusal ölçekler ve arksinh ölçekleri olan kanalları karıştırmayın.

viSNE sonuçlarının yorumlanması


• ViSNE harita kalitesini değerlendirme

Herhangi bir keşif amaçlı veri analizi için viSNE aracını kullanmadan önce, gelişmiş viSNE ayarlarının herhangi birini detaylı olarak ayarlayıp ayarlamadığınızı kontrol etmek isteyeceksiniz. Sütunlardaki her kanala göre renklendirilmiş satırlardaki her dosya için viSNE haritasını gösteren bir çalışma illüstrasyonu oluşturun. Bu çalışma illüstrasyonunu inceleyerek viSNE haritasının kalitesini değerlendirin ve iyi bir şekilde birleştiğinden emin olun.



Şekil 6. 20 renkli Akış Sitometresi Verilerinin viSNE Görselleştirmesi. viSNE, geçitlendirilmiş tekli hücrelerde çalışıldı, viSNE kanalları olarak 19 işaretleyici seçildi. 100.000 olay için viSNE ayarı: 1000 yineleme, 30 perpleksite ve 0,5 teta (varsayılan ayarlar). Her bir diyagramın sol üst köşesinde etiketlenen her bir işaretleyici ekspresyonunun yoğunluğu, sağdaki diyagram ölçeğiyle gösterilir.

İyi bir şekilde birleştirilmiş bir viSNE haritasında, benzer kümeleme belirteçleri ekspresyonuna sahip hücreler ya ayrı viSNE adacıkları (diğer hücre türlerinden çok farklıysa) ya da viSNE adacıkları içindeki ayrı bölgeler oluştururlar. Zayıf bir şekilde birleştirilmiş bir viSNE haritasının üst üste binen ve kötü biçimlendirilmiş adacıkları olacaktır ve bu adacıklar tek bir işaretleyicinin ekspresyonunu harita üzerindeki farklı konumlara ayırmaz (Şekil 7A). Belirli bir belirteci eksprese eden hücreler dizi benzeri veya uzun ince paternde görünebilir. viSNE haritası zayıf bir şekilde birleştirilmiş ise, viSNE'yi ek yinelemelerle yeniden çalışmanız gerekir (Şekil 7B). viSNE haritaları da çok iyi ayrılmamış adacıklarla birleştirilebilir. Bu durumda, viSNE'yi daha yüksek perpleksite ile yeniden çalışmalısınız (Şekil 7C). Gerekirse, bulgularınıza göre ayarları oluşturarak viSNE'yi yeniden çalıştırın.


Şekil 7. 20-renkli Akış Sitometresi Verilerinin viSNE Görüntülemesi. viSNE, geçitli canlı tekli hücrelerde çalışılmıştır, viSNE kanalları olarak 19 belirteç seçilmiştir. viSNE ayarları belirtildiği şekilde seçilmiştir. Her bir diyagramın üst kısmında etiketlenen her bir işaretleyici ekspresyonunun yoğunluğu, sağdaki diyagram ölçeğiyle gösterilir.



Yalnızca Araştırma Amaçlı Kullanım İçindir. Tanılama prosedürlerinde kullanmak için uygun değildir.

 

Referanslar

1. Amir, E. D., Davis, K. L., Tadmor, M. D., Simonds, E. F., Levine, J. H., Bendall, S. C., Shenfeld, D. K., Krishnaswamy, S., Nolan, G. P., & Pe’er, D. (2013). ViSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. [ViSNE, yüksek boyutlu tek hücreli verilerin görüntülenmesini sağlar ve löseminin fenotipik heterojenliğini ortaya çıkarır.] Nature Biotechnology, 31(6), 545–552. https://doi.org/10.1038/nbt.2594


2. Van Gassen, S., Callebaut, B., Van Helden, M. J., Lambrecht, B. N., Demeester, P., Dhaene, T., & Saeys, Y. (2015). FlowSOM: Using self-organizing maps for visualization and interpretation of cytometry data: FlowSOM. [Sitometre verilerinin görselleştirilmesi ve yorumlanması için kendi kendini düzenleyen haritaların kullanılması: FlowSOM] Cytometry Part A, 87(7), 636–645. https://doi.org/10.1002/cyto.a.22625