Dizileme ile Transkriptomların ve Epitopların CITE-seq veya Hücresel İndislenmesi [1], tek hücreli biyolojisinin incelenmesine yönelik yapılan en son yeniliklerden biridir. Araştırmacıların aynı hücrelerdeki RNA ve yüzey proteini ekspresyonunu yeni nesil dizileme teknolojisi sayesinde aynı anda yakalamasını sağlar. Bilim insanları iki veri türünü ilişkilendirebilir, biyobelirteçleri tanımlayabilir ve hücre fenotiplerini daha iyi karakterize edebilir [2]. Ancak, iki veri türünün normalleştirilmesi ve karşılaştırılması, veri analizi açısından da zorluklar içermektedir. CITE-seq veri analizini kolaylaştırmak ve daha fazlasını keşfetmenize yardımcı olmak istiyoruz.

Burada Cytobank platformunu kullanan ve çoklu-omik CITE-seq verilerinizi etkili bir şekilde analiz etmenize yardımcı olacak bir yaklaşım sunulmaktadır.

Bu üç adımlı iş akışı, CITE-seq verilerini analiz etmek için genel bir yaklaşım sağlar ve üçüncü taraf yazılım, Cytobank tarafından geliştirilen R komut dosyası ve mevcut Cytobank platformunu entegre eder.

1. Bir dizileme eşleyici ham gen dizileme okumalarını bir referans genoma eşler (GRCh38 veya GRCh37 gibi) ve eşlenen dizileme okumalarının konumuna bağlı olarak gen ekspresyonunu bilgilendirir. Biz, 10X Genomikten elde edilen verilerin hizalanması için Cell Ranger kullanılmasını öneririz. Diğer tek hücreli RNA-seq veri türlerinin hizalanması için STAR kullanabilirsiniz. CITE-seq-Count daha sonra CITE-seq verilerinde bulunan antikor okumalarını işleyebilir ve ham antikor ekspresyon sayım matrisini üretebilir.
2. Geliştirdiğimiz bir R komut dosyasını kullanarak ham gen ve antikor ekspresyon verilerini normalleştirin ve filtreleyin. Komut dosyası, ham verilerdeki paraziti gidermek için otomatik olarak birkaç veri KK filtresi uygular ve dizileme derinliği yanlılığını düzeltmek için filtrelenen verileri normalleştirir. Komut dosyası ayrıca gen ve antikor ekspresyonunu birleştirecek ve örnek başına birleştirilmiş ekspresyon dosyası çıktısı oluşturacaktır.
3. İşlenen verileri DROP aracılığıyla Cytobank'a yükleyin ve CITE-seq verilerinizde kodlanmış zenginleştirilmiş bilgileri açmak için Cytobank makine öğrenimi algoritmalarını (viSNE, FlowSOM ve CITRUS) kullanmaya başlayın. Daha fazla ayrıntı için aşağıdaki bölüme bakınız. 

CITE-seq + viSNE ile Temel Veri Paternlerini Keşfedin

CITE-seq verilerinizin hızlı bir görünümü için, viSNE'yi filtrelenmiş ve normalleştirilmiş tek hücreli RNA-Seq gen ekspresyon verileriyle çalıştırabilirsiniz. Satija Lab'dan indirilen örnek bir veri kümesini kullanarak, viSNE'nin CITE-seq gen ekspresyon verilerine dayanarak hücre olaylarını başarılı bir şekilde ayırdığını gördük (Şekil 2).

Şekil 1. CITE-seq verileri, iyi tanımlanmış popülasyonlar oluşturur. Tüm genleri kullanmak yerine, bir kordon kanı mononükleer hücrelerine yönelik örnek verilerin altta yatan veri paternini etkili bir şekilde ortaya çıkarmak için en yaygın ve en değişken 700 geni içeren hücreleri kümeledik.

Gen Kümelerindeki Antikor İfadesine Daha Yakından Bir Bakış

Gen ekspresyonu kümeleme sonucunu doğrulamak için, antikor ekspresyonunu gen kümelerinde katmanlandırabilirsiniz (Şekil 2).

Şekil 2. Gen ve Protein Ekspresyonunu Üst Üste Bindirin. Kırmızı ve sarı noktalar, tSNE diyagram başlığında belirtilen yüzey proteininin yüksek ekspresyonunun görüldüğü olaylardır.

Cytobank platformunda, ısı haritası ile tanımlanan hücre popülasyonlarında yüzey proteini ekspresyonunu da görselleştirebilirsiniz (Şekil 3).

Ayrıca yüzey proteinlerinin ve karşılık gelen protein kodlayıcı genlerin birlikte ekspresyonuna da bakabilirsiniz (Şekil 4). 

 

 

Şekil 4. Gen ve Protein Ekspresyonu Korelasyonunu Gösteren Isı Haritası. CD3D ve CD3E, CD3'ün protein kodlayıcı genleridir. FCGR3A, CD16'nın kodlama genidir. CD8, karşılık gelen protein kodlayıcı genleri olarak CD8B ve CD8A'yı içerir. Isı haritası, gen ekspresyonunun tanımlanan hücre popülasyonu genelinde protein ekspresyonuna karşılık geldiğini göstermektedir.

Cytobank Çalışma İllüstrasyonunda bir üst üste bindirilmiş nokta grafiği oluşturarak protein ekspresyonu ile gen ekspresyon verileri arasında ne düzeyde korelasyon olduğunu öğrenmek için yüzey proteinlerini tek tek inceleyebilirsiniz (Şekil 5). Bu örnekte, CD3'ün ekspresyonu, düşük gen ekspresyonuna ve yüksek antikor ekspresyonuna sahip bir hücre kümesi olsa dahi CD3E geninin ekspresyonu ile pozitif olarak ilişkilidir.

Şekil 5. Gen ve Protein Ekspresyonu Korelasyonunu Gösteren Nokta Diyagramı. Yukarıdaki nokta diyagramının x ekseni protein ekspresyonunu göstermektedir. Diyagramın y ekseni gen ekspresyonunu göstermektedir.

CITE-seq, hücre içi gen ekspresyonunu ve hücre dışı protein işaretleyici ekspresyonunu tek hücreli çözünürlük düzeyinde eş zamanlı olarak incelemenizi sağlayan güçlü bir teknolojidir. Bu iş akışı, Cytobank platformunda entegre bir analiz gerçekleştirmenizi sağlar. Bu, Cytobank için bu alandaki ilk adımdır ve biz CITE-seq verilerini analiz etmek için ek iş akışları geliştirmekle ilgileniyoruz ve neyin faydalı olacağına ilişkin geri bildirimlerinizi almaktan memnuniyet duyuyoruz.

Yalnızca Araştırma Amaçlı Kullanım İçindir.  Tanılama prosedürlerinde kullanmak için uygun değildir.