Örneklerde Akış Sitometresi Verilerinin Karşılaştırılması

Anlamlı içgörüler genellikle farklı örneklerden, örneğin farklı zaman noktalarından veya hücre kültürü koşullarından elde edilen sonuçlar karşılaştırılarak üretilir. Histogram ve noktasal grafiklerde yer alan katmanlar bu tür verilerin görüntülenmesine yardımcı olabilir (Şekil 1) ve çoğu akış sitometresi yazılım paketinde mevcuttur.

Şekil 1. T Hücre Sitokin Ekspresyonu Karşılaştırması. Uyarılmamış (kontrol, mavi) ve uyarılmış (kırmızı) CD4+ T hücrelerinin karşılaştırması. Üreticinin talimatlarına uygun olarak DURActiv 1 * (Parça Numarası C11101) kullanılarak normal bir tam kan örneği aktifleştirildi ve DURAClone IF T Yardımcı Hücre Tüpü * (Parça Numarası C04666) ile boyandı. A ve B sırasıyla IFN gamma ve IL-4 ekspresyonunun histogramdaki katmanları gösterir. Şekil C, her iki sitokin için nokta grafiğindeki katmanları göstermektedir. Diyagramlar yalnızca gösterim amaçlıdır.

Bununla birlikte, gelişmiş istatistiksel analiz ve hücre sıklığı ve işaretleyici çokluğu karşılaştırmaları yapmak için, çizelge programlarında veya istatistiksel yazılımda istatistiksel sonuçların ve veri analizinin dışa aktarılması çoğu zaman gereklidir. Karşılaştırma Diyagramı, kullanıcının veri kümeleri ve popülasyonlar genelinde belirli bir istatistiği karşılaştırmasına olanak tanır, böylece akış sitometresi verilerinin analizi için kullanılan yazılımda doğrudan çizgi ve çubuk grafiklerin görselleştirilmesine izin vererek iş akışını kolaylaştırır (Şekil 2).

Şekil 2. Bir Kontrol ve Stimülasyon Örneğinde IL-4 ve IFN Gamma Eksprese Eden CD4+ T hücrelerinin Çubuk Grafik Görselleştirmesinin Karşılaştırma Diyagramı. Üreticinin talimatlarına uygun olarak DURActiv 1 * (Parça Numarası C11101) kullanılarak normal bir tam kan örneği aktifleştirildi ve DURAClone IF T Yardımcı Hücre Tüpü * (Parça Numarası C04666) ile boyandı. Diyagramlar yalnızca gösterim amaçlıdır.

T hücresi TCR Vbeta Repertuarının Akış Sitometresi ile Tespiti

TCR repertuar analizi, bağışıklık sistemini daha iyi anlamak için son derece önemlidir. Akış sitometresi, hücre başına bazda çoklu T hücresi alt kümelerindeki oransal TCR-Vβ kullanımını hücre ölçümüne gerek olmadan hızlı bir şekilde ölçer ¹. IOTest Beta İşareti TCR Vβ Repertuar Kiti (IM3497), normal insan TCR Vβ repertuarının yaklaşık %70’ini içeren 24 farklı TCR Vβ değerlendirmesine izin verir. Repertuarın çeşitliliği, genel T hücreleri arasında her TCR Vβ yüzdesi veya belirli alt kümeler ve belirli bir klonun potansiyel genişlemesinin görünürlüğü hakkında bir özet sağlar.

Vβ özgüllüklerinin karşılıklı dışlamalı kombinasyonlar halinde gruplanabileceği gerçeğinden yararlanarak, aynı tüpte 3 Vβ ekspresyonunun saptanması, üç monoklonal antikoru yalnızca iki floroforla birleştiren yenilikçi bir boyama stratejisi kullanılarak mümkündür. Tarihsel olarak, belirli bir TCR Vβ zincirini eksprese eden T hücrelerinin yüzdesi, akış sitometresi analiz yazılımı kullanılarak belirlenmiş ve dağıtımı klonogram olarak görselleştirilmek üzere bir çizelge programına aktarılmıştır. Kaluza Karşılaştırma Diyagramı kullanılarak, ikinci bir yazılım paketine veri aktarımına gerek kalmadan karşılaştırılabilir bir görselleştirme elde edilebilir (Şekil 3).

Şekil 3. CD3+ T hücrelerinde TCR Vβ Repertuarının Klonogram Gösterimi. Normal bir tam kan örneği, IOTest Beta Mark TCR Vβ Repertuar Kiti * (Parça Numarası IM3497) ile üreticinin talimatlarına göre boyanmıştır. Diyagramlar yalnızca gösterim amaçlıdır.

Karşılaştırma Diyagramını kullanarak TCR Vβ klonogramı oluşturma

1. Beta Mark TCR Vβ Repertuar Kitini kullanarak 8 tüpte bir örneği boyayın ve akış sitometresinde veri elde edin. Ayrıntılı protokol ve metodoloji için, lütfen beckman.com/techdocs adresinde bulunan kit kullanım talimatlarına bakın.
2. Sonuçta elde edilen 8 adet veri dosyasını Kaluza’da yükleyin ve analiz etmek istediğiniz T hücresi alt kümesini tanımlamak için bir geçitleme stratejisi oluşturun. CD3+ T hücreleri için örnek bir geçitleme stratejisi Şekil 4'te verilmiştir. Kaluza’da diyagramların ve geçitlerin nasıl oluşturulacağına ilişkin ayrıntılı talimatlar için Kaluza IFU’ya (Parça Numarası C10986) başvurun.





Şekil 4. Tüp A'dan Gelen Veri Örneği. Lökositler, CD3 kullanılarak yan ve ileri saçılımlar ve T hücreleri kullanılarak geçitlenir. Her tüpün üç TCR Vβ'sı noktasal grafikte görüntülenir ve TCR Vβ hem FITC hem de PE'ye konjüge edilerek çift pozitif kadranın diyagonalinde görünür. Normal bir tam kan örneği, IOTest Beta Mark TCR Vβ Repertuar Kiti * (Parça Numarası IM3497) ile üreticinin talimatlarına göre boyanmıştır. Diyagramlar yalnızca gösterim amaçlıdır.



3. Protokolü yeni oluşturulan geçitleme stratejisi ile geri kalan 7 dosyaya sürükleyip bırakma veya kopyala + özel yapıştır özelliğini kullanarak kopyalayın. Bu, tüm geçitlerin ve kadranların, aşağı akış görüntülemesi için kritik bir özellik olan tüm veri kümelerinde aynı adlara sahip olmasını sağlar.
4. 8 dosyanın tümünün bir Birleşimini oluşturun. Gezinmeyi kolaylaştırmak için tek bir diyagram sayfasında tüm örnekler için oluşturulan diyagramları kesmek ve yapıştırmak isteyebilirsiniz.
5. İsteğe bağlı: T hücresi alt kümelerini tanımlamak için kullanılan geçitlere bağlantı verin. Bu, bir veri kümesi için geçitte yapılan değişiklikleri diğer tüm veri kümelerine uygulayacaktır. Geçitleri bağlamak için farenizi geçidin üzerine getirin, sağ tıklayın ve Radyal Menü öğesine erişim sağlayın ve Veriler menüsüne gidin. Link to Gates (Geçitlere Bağla) hiperlinkini seçin. Bağlanmaya uygun geçitlerin listesiyle birlikte açılır bir pencere görünür. Mevcut geçide bağlamak istediğiniz geçitleri seçin.
6. Yeni bir Karşılaştırma Diyagramı oluşturun ve y eksenini geçitlenen % olarak değiştirin. (Seri ekle) seçeneğini seçerek ve Input Gate (Giriş Geçidi) açılır menüsünden kadran adlarını sıralı olarak seçerek Vβ zinciri eksprese eden hücreleri seri olarak tanımlamak üzere kullanılan kadranları ekleyin.
   
   
   

   Şekil 5: Karşılaştırma Diyagramı Kurulumu. Soldaki yoğunluk diyagramı, Vβzincirini eksprese eden hücreleri tanımlamak için kullanılan kadranları gösterir. Karşılaştırma Diyagramı 3 veri serisi içerir. Kadran A++ ve A-+ halihazırda uygun şekilde atanmış. Normal bir tam kan örneği, IOTest Beta Mark TCR Vβ Repertuar Kiti * (Parça Numarası IM3497) ile üreticinin talimatlarına göre boyanmıştır. Diyagramlar yalnızca gösterim amaçlıdır.

7. Karşılaştırma Diyagramına sağ tıklayarak ve Radyal menüden Görüntüle seçeneğini seçerek Karşılaştırma Diyagramı’ndan Çubuk Grafiğine geçin.
   
   
   

   Şekil 6. Karşılaştırma Diyagramı Görüntüleme Ayarları. Normal bir tam kan örneği, IOTest Beta Mark TCR Vβ Repertuar Kiti * (Parça Numarası IM3497) ile üreticinin talimatlarına göre boyanmıştır. Diyagramlar yalnızca gösterim amaçlıdır.

8. Etiketleri ve renkleri değiştirme: Şekil 2 ile karşılaştırılabilir bir sonuç elde etmek için aşağıdaki ayarlamaları yapın:
   1. Renklendirme alt menüsüne erişerek çubukların rengini değiştirin. Renklendirme birinci, ikinci ve üçüncü çubuk için atanır ve tüm veri kümelerinde aynı olacaktır.
   2. Diyagram açıklamasını kaldırmak için Görüntüle menüsüne erişin.
   3. Görüntüle menüsüne erişin ve Vβ zincirlerinin Başlık olarak geçitlendiği popülasyonu belirtin.
   4. Ekran menüsüne erişin ve “Özel eksen kullan” seçeneğini seçin. TCR Vbeta'yı X ekseni başlığı olarak girebilirsiniz.
9. Çubukları karşılık gelen TCR Vβ zincirleriyle etiketlemek için radyal menüye erişim sağlayın ve Geçitler ve Araçlar menüsünü seçin. Ek Açıklama öğesini seçin. Bir metin kutusu oluşturmak için farenizle tıklayıp diyagram üzerinde sürükleyin. Kutu tercih ettiğiniz boyuta geldiğinde fare düğmesini bırakın. Metin kutusuna sağ tıklayın ve Radyal Menüden Veri alt menüsüne erişin. Veri alanının içine tıklayın ve açıklama metnini yazın, bu durumda TCR Vβ zincirleri belirli bir kadranda tespit edilir. Metin kutusunu kadrana karşılık gelen çubuğun üzerine getirin. Tüm çubuklar için tekrarlayın.

Şekil 7. Açıklama Özelliğini Kullanarak Çubuk Etiketleri Ekleme. Normal bir tam kan örneği, IOTest Beta Mark TCR Vβ Repertuar Kiti * (Parça Numarası IM3497) ile üreticinin talimatlarına göre boyanmıştır. Diyagramlar yalnızca gösterim amaçlıdır.

Y Ekseni ölçeğini kontrol etmek istiyorsanız, Radyal menüsüne erişin ve Veri öğesini seçin. Manuel Y Ekseni ölçeği kutusunu işaretleyin ve istediğiniz Minimum ve Maksimum değeri girin.

Şekil 8. Karşılaştırma Diyagramında Manuel Y Ölçeği Ayarı. Normal bir tam kan örneği, IOTest Beta Mark TCR Vβ Repertuar Kiti * (Parça Numarası IM3497) ile üreticinin talimatlarına göre boyanmıştır. Diyagramlar yalnızca gösterim amaçlıdır.

Özet

Kaluza Karşılaştırma Diyagramı, veri kümeleri ve giriş popülasyonları arasındaki popülasyon miktarındaki farklılıkların görselleştirilmesini destekler. Bir akış sitometresi veri analizi paketindeki çizgi ve çubuk grafiklere erişilebilirlik, iş akışlarını kolaylaştırmaya yardımcı olur ve verilerin dışarı aktarılmasını ve diğer yazılım paketlerine aktarılmasını gereksiz kılar.

Referanslar

1. van der Geest KSM, Abdulahad WH, Horst G, et al. Quantifying Distribution of Flow Cytometric TCR-Vβ Usage with Economic Statistics. [Ekonomik İstatistiklerle Akış Sitometrik TCR-Vβ Kullanımının Dağılımının Sayısallaştırılması] Turner SJ, ed. PLoS ONE. 2015;10(4):e0125373. doi:10.1371/journal.pone.0125373



* Yalnızca Araştırma Amaçlı Kullanım İçindir. Tanılama prosedürlerinde kullanmak için uygun değildir.