Giriş

Akış sitometresi deneyleri için genellikle popülasyonlar arasındaki ve hatta farklı zaman noktalarından veya stimülasyon koşullarından elde edilen örnekler arasındaki ekspresyon paternlerinin karşılaştırılması tercih edilir. Overlay (Katman) diyagramları, tek bir diyagramda birden fazla histogram, nokta veya yoğunluk diyagramları içerir ve kullanıcının paternleri karşılaştırmasını sağlar. Bakınız Şekil 1.

Şekil 1. Tam Kan Numunelerinden Katman Örnekleri. Üreticinin talimatları uyarınca DURActive 3 (Parça Numarası C21857) kullanarak stimülasyonlu ve stimülasyonsuz tam kan örneklerinden katman örnekleri. Örnekler IFU'yu takiben DURAClone IF Monosit Aktivasyon Antikor Paneli (Parça Numarası C21858) ile boyanmıştır ve veriler CytoFLEX akış sitometresinde elde edilmiştir. A) Gösterilen, CD14+ hücrelerinde geçitlenmiş bir kontrol örneğinden alınan ve granülosit (Gra) geçidinde ve CD14+ hücrelerinde geçitlenmiş, uyarılmış örneklerden alınan nokta diyagramı katmanıdır. B) Uyarılmamış kontrolün ve DURActive 3 ile uyarılmış örneklerin histogram katmanı. Diyagramlar yalnızca gösterim amaçlıdır.

Overlay (Katman) diyagramları ayrı veri kümeleri, birleştirilmiş veri kümeleri ve Kompozit veri kümeleri içinde bir veri karşılaştırma aracı olarak kullanılabilir. Overlay (Katman) diyagramında 12 adede kadar diyagramı karşılaştırabilirsiniz ve ofset veya açılı seçenekler gibi farklı histogram görselleştirmeleri mevcuttur, bkz. Şekil 2.

Şekil 2. Ofsetli Histogram Katmanı.  Artan uyarıcı konsantrasyonları uygulanan, üreticinin talimatlarına göre DURAClone IF Bazofil Aktivasyon Antikor Paneli (Parça Numarası C23406) kullanılarak boyanmış ve CytoFLEX akış sitometresinde edinilmiş 5 tam kan örneğinin ofset histogram katmanı. Diyagramlar yalnızca gösterim amaçlıdır.

Bir Veri Kümesindeki Popülasyonların Karşılaştırılması

Dosyaları yükleme ve diyagramlar ve geçitler dahil analizler oluşturma hakkında ayrıntılı talimatlar için lütfen Kaluza Analysis Akış Sitometresi Yazılımı IFU C10986 belgesine başvurun.

• Analiz edilecek veri dosyalarını yükleyin ve karşılaştırılacak popülasyonları tanımlayın.
  
  

Şekil 3. Hiyerarşik Geçitleme. CD4+ (açık mavi) ve CD8+ (pembe) T hücresi alt kümelerini tanımlamak için hiyerarşik geçitleme. PBMC'ler özel kuru reaktif paneli kullanılarak boyanmıştır ve veriler CytoFLEX LX akış sitometresinde elde edilmiştir. Diyagramlar yalnızca gösterim amaçlıdır.

• Katman diyagramı oluşturmak için, Plots & Tables (Diyagramlar ve Tablolar) şerit sekmesinden Overlay [Katman] simgesi üzerindeki aşağı açılır oku seçin ve istenilen türü belirleyin: Histogram, Dot veya Density (Histogram, Nokta veya Yoğunluk). Aşağıdaki bölümde, bir Histogram Katmanı örnek olarak gösterilecektir.

• Input Gate (Giriş Geçidi), Parameter (Parametre), Scale (Ölçek), Color (Renk) öğelerini seçmek için Overlay (Katman) diyagramının yanındaki (Katman Ekle) hiperlinkini kullanın veya bir diyagramı kaldırmak için Delete (Sil) öğesini seçebilirsiniz.

• Radyal menüleri kullanarak diyagramınızı özelleştirmeye devam edin. Bu örnekte, veri ölçeklendirmesi Logicle'a geçirilmiştir. Logicle ölçeği negatif değerler görüntülemesini doğru kullanma, doğru telafi edilmiş verilerin istenen simetrik görünümünü koruma ve çok renkli verileri görüntülerken faydalı olabilir. y Parametresi % Geçitli olarak değiştirildi. % Geçitli seçeneği, olay sayısı açısından farklılık gösteren popülasyonların karşılaştırmasını kolaylaştırır. % Maks. seçeneği, Histogramları normalleştirmenizi sağlar. % Geçitli, veri kümeleri arasındaki sayısal farkların daha doğru bir sunumunu sağlasa da, % Maks., tüm veri kümelerinin maksimum değerini aynı seviyeye getiren bir görselleştirme sağlar. Verilerinizi düzeltmek daha hoş bir görünüm sağlayabilir.

• Display (Görüntüle) menüsünü Katman diyagramı için görünüm özelliklerini belirlemek için kullanın. Histogram Type (Histogram Türü) öğesini seçin. Aşağıdaki görüntüleme seçenekleri mevcuttur: 
  
  • Katman: Kompozit galeri sunumu.
  • Ofset: Ölçeğe bağlı olarak Katman üzerindeki her bir Histogram veya diyagramı ofsetler. Tüm Histograms (Histogramlar) öğelerini, dikey bir ofset üzerine, çakışmayı önleyecek şekilde ölçeklendirilmiş olarak yerleştirir.
  • HalfOffset (Yarı Ofset): Daha uzun ve çakışabilecek Histograms (Histogramlar) için dikey ofsetin yarısını kullanır.
  • Açı: Açılı diyagramlar (açı derecesini ayarlamak için döndürme noktasını kullanın)

BAŞARI İÇİN İPUCU:
Tüm diyagramlar aynı ölçeği kullanıyorsa eksen onay işaretleri görüntülenir.

Farklı Veri Kümelerinden Popülasyonların Karşılaştırılması

BAŞARI İÇİN İPUÇLARI:

• Farklı veri kümelerinden bir katman diyagramına popülasyonlar eklemek için, karşılaştırılacak tüm veri kümelerini içeren bir Kompozit oluşturmak gerekir. Kompozit oluşturmayla ilgili ayrıntılı talimatlar için Kaluza Analysis Flow Cytometry Software (Kaluza Analysis Akış Sitometresi Yazılımı) IFU C10986’ya bakın.
• Geçitleme stratejisini birkaç kez yeniden oluşturmak zorunda kalmamak için olası bir iş akışı, bir Kompozit oluşturmadan önce geçitleme stratejisini oluşturmak ve tüm veri kümelerine kopyalamaktır.
• Analiz edilecek veri dosyalarını yükleyin ve karşılaştırılacak popülasyonları tanımlayarak bir geçitleme stratejisi oluşturun. Protokolü tüm veri kümelerine uygulamak için Sürükle ve Bırak veya Kopyala + Özel Yapıştır seçeneklerini kullanın. Ayrıntılı talimatlar için Kaluza Analysis Flow Cytometry Software (Kaluza Analysis Akış Sitometresi Yazılımı) IFU C10986’ya bakın.
• Analiz edilecek tüm Veri Kümeleri öğesini seçin ve bir Kompozit oluşturun. 
• Katman diyagramı oluşturmak için, Plots & Tables (Diyagramlar ve Tablolar) şerit sekmesinden Overlay [Katman] simgesi üzerindeki aşağı açılır oku seçin ve istenilen türü belirleyin: Histogram, Dot veya Density (Histogram, Nokta veya Yoğunluk). 
  Data Set (Veri Kümesi), Input Gate (Giriş Geçidi), Parameter (Parametre), Scale (Ölçek), Color (Renk) öğelerini seçmenize olanak tanıyan Overlay (Katman) diyagramının yanındaki (Katman Ekle) hiperlinkini, bir Histogram Konfigürasyonunu ve Katman Konfigürasyonu ekran görüntüsünü kullanın veya bir diyagramı kaldırmak için Delete (Sil) öğesini seçin.
• Diyagramınızı Tek Bir Veri Kümesinde Popülasyonları Karşılaştırmak için açıklanan şekilde özelleştirmeye devam edin.
  
  
  

Farklı Veri Kümelerinden veya Bir Veri Kümesi İçinden Mevcut Diyagramları Karşılaştırma

• (Alt) tuşunu basılı tutun ve mevcut bir diyagramı, parametrelerini Overlay (Katman) diyagramına eklemek üzere sürükleyin.

NOT: Overlay (Katman) diyagramına birden çok diyagram, (Alt) tuşuna basmadan önce çoklu olarak seçilerek aynı anda sürüklenebilir.

Kullanım Durumu: viSNE Haritalarının Katmanlarını Oluşturma

Örneğin Cytobank platformunda bir viSNE analizini gerçekleştirdikten ve fcs dosyalarını indirdikten sonra tSNE parametreleri içeren veri kümeleriniz varsa, dosyaları birleştirmeye gerek kalmadan farklı örneklerden elde edilen verileri içeren kapsamlı viSNE haritaları oluşturmak için Kaluza’yı kullanabilirsiniz.

• tSNE parametrelerini içeren dosyaları yükleyin.
• Analiz edilecek örnekleri içeren bir Kompozit oluşturun.
• tSNE1 ve tSNE2 ile sırasıyla x ve y Parametresi olarak olan tüm veri kümeleri için nokta diyagramları oluşturun. Logicle ölçeklendirmesini seçin ve doğrusal ölçeklendirme sıfırın üstünde ve altında olacak şekilde viSNE haritasını görselleştirmek için kaydırıcıyı eksenlerin maksimumuna getirin.
• Dot Plot Overlay Plot (Nokta Diyagram Katman Diyagramı) oluşturun, Overlay’e (Katman) eklenecek nokta diyagramlarını çoklu olarak seçin, Alt tuşuna basın ve nokta diyagramlarını Katman Diyagramı üzerine sürükleyin ve bırakın.
  
  
  Bu belge, Kullanım Talimatlarının yerine geçmez.
  * Yalnızca Araştırma Amaçlı Kullanım İçindir. Tanılama prosedürlerinde kullanmak için uygun değildir.