DURAClone IF Monosit Aktivasyon Protokolü

Bu protokol yalnızca referans amaçlıdır.  Yöntemi belirli araştırma ihtiyaçları için uyarlama yapılması gerekebilir.

Malzemeler

KİT KUTUSU İÇERİĞİ

DURAClone IF Monosit Aktivasyonu Antikor Paneli için 25 test 

NOT: Reaktif tüplerini buzdolabında saklamayın, tüplere dondurma/çözdürme işlemi uygulamayın. Özellikle edinme öncesinde numunenin/numunelerin işlenmesi ve inkübasyonu sırasında tüplerin ışığa maruz kalmasını en aza indirin.

GEREKLİ OLAN ANCAK SAĞLANMAYAN MALZEME

Sodyum heparin antikoagülanı içeren kan toplama tüpü

Kalibre edilmiş pipetler

Vorteks mikser

PerFix-nc Hücresel Boyama Hazırlama Kiti (Parça Numarası B10825):

  • Tampon 1, fiksatif reaktif
  • Tampon 2, permeabilizan reaktif
  • Tampon 3, nihai çözelti, 10X konsantre.  Kullanmadan önce 1X'e seyreltin. 

Aşağıdaki lazerler ve dedektörlerle donatılmış akış sitometrisi:

  • FSC/SSC
  • 405 nm: 430 – 470 nm, 530 – 570 nm
  • 488 nm: 560 – 600 nm
  • 633 nnm: 715 – 735 nm

Kılıf sıvısı

Akış sitometrisi kalibrasyon boncukları

Boyama İşlemi

TAM KAN İÇİN NUMUNE HAZIRLAMA  

  1. 50 μL aktif kandan uygun şekilde etiketlenmiş bir test tüpüne.

  2. 5 μL PerFix-nc Tampon 1 ekleyin. Kırmızı pelet ayrılıncaya kadar vorteksleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

  3. 300 μL PerFix-nc Tampon 2 ekleyin. Vorteks.

  4. İçeriği DURAClone IF Monocyte Aktivasyon Antikor Panelinin bir tüpüne aktarın.

  5. Tüpleri yüksek hızda 6-8 saniye vorteksleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Işıktan koruyun.

  6. 3 mL PerFix-nc Tampon 3 ekleyin. Vorteks.

  7. Numune, edinme için hazırdır. FS parametresindeki ayırıcıyı lökositlerin edinmenin dışında bırakılmayacağını garanti etmek için yeterince düşük bir değere ayarlayın.

Analysis (Analiz)

  1. CD45-Krome Orange ile SSC karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun. CD45+ lökositlerini kapsayacak bir bölge oluşturun.

  2. CD14-Pasifik Mavi ile SSC karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun. CD45+ geçidini bu grafiğe uygulayın. CD14+ monositlerini kapsayacak bir bölge oluşturun.

  3. CD45+ CD14+ monositlerinde, alt kümeleri ayırt etmek için TNFα-Alexa Fluor-700 ile HLA-DR-PE karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği ve bir kadran geçidi oluşturarak HLA-DR-PE ve TNFα-Alexa Flor-700 ekspresyonunu değerlendirir: HLADR+ TNFα-, HLA-DR+ TNFα+, HLA-DR- TNFα+ ve HLA-DR- TNFα- hücreleri.