DURAClone IF T Yardımcı Hücre Protokolü

Bu protokol yalnızca referans amaçlıdır.  Yöntemi belirli araştırma ihtiyaçları için uyarlama yapılması gerekebilir.

Malzemeler

KİT KUTUSU İÇERİĞİ

DURAClone IF T Yardımcı Hücre Antikor Paneli için 25 test

3 kompenzasyon kiti, her kit beş adet tek renkli tüp içerir:

  • CD4-FITC
  • IL4-PC7
  • CD4-APC
  • CD3-Alexa Flor 750
  • CD4-Pacific Blue

NOT: Reaktif tüplerini buzdolabında saklamayın, tüplere dondurma/çözdürme işlemi uygulamayın. Özellikle edinme öncesinde numunenin/numunelerin işlenmesi ve inkübasyonu sırasında tüplerin ışığa maruz kalmasını en aza indirin.

GEREKLİ OLAN ANCAK SAĞLANMAYAN MALZEME

Sodyum heparin antikoagülanı içeren kan toplama tüpü

Kalibre edilmiş pipetler

Vorteks mikser

PerFix-nc Hücresel Boyama Hazırlama Kiti (Parça Numarası B10825):

  • Tampon 1, fiksatif reaktif
  • Tampon 2, permeabilizan reaktif
  • Tampon 3, nihai çözelti, 10X konsantre.  Kullanmadan önce 1X'e seyreltin.

Fosfat Tamponlu Salin, PBS (Parça Numarası 6603369 veya eşdeğeri)

  •  Kullanma Talimatına uygun olarak hazırlanmıştır.

Fetal Sığır Serumu

VersaComp Antikor Yakalama Boncuğu Kiti (Parça Numarası B22804)

Aşağıdaki lazerler ve dedektörlerle donatılmış akış sitometrisi:

  • FSC/SSC
  • 405 nm: 430 – 470 nm
  • 488 nm: 504 – 545 nm, 560 – 600 nm, >755 nm
  • 633 nnm: 715 – 735 nm ve >755 nm

Kılıf sıvısı

Akış sitometrisi kalibrasyon boncukları

Boyama İşlemi

TAM KAN İÇİN NUMUNE HAZIRLAMA  

  1. Uygun şekilde etiketlenmiş bir test tüpüne 50 μL aktif kan ekleyin.

  2. 25 μL PerFix-nc Tampon 1 ekleyin. Kırmızı pelet ayrılıncaya kadar vorteksleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

  3. 2 mL 1X PBS ekleyin. 5 dakika boyunca 200 x g’de vorteksleyin ve santrifüjleyin. Üst fazı aspire edin.

  4. 25 μL Fetal Bovin Serum ekleyin. Peleti yeniden süspanse etmek için vorteksleyin.

  5. 300 μL PerFix-nc Tampon 2 ekleyin. Vorteks.

  6. İçeriğin tamamını DURAClone IF T Yardımcı Hücre Antikor Paneli'nin bir tüpüne aktarın. 

  7. Tüpleri yüksek hızda 6-8 saniye vorteksleyin. Oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Işıktan koruyun.

  8. 3 mL PerFix-nc Tampon 3 ekleyin.

  9. 5 dakika boyunca 500 x g’de vorteksleyin ve santrifüjleyin. Üst fazı aspire edin.

  10. Hücreleri 500 μL PerFix-nc Tampon 3 içinde yeniden süspanse edin.

  11. Numune analize hazırdır.

PERİFERİK KAN MONONÜKLEER HÜCRELERİ İÇİN NUMUNE HAZIRLIĞI 

  1. Etiketlenmiş bir test tüpüne 50 μL aktive edilmiş PBMC (~5 x105 hücre içeren) ekleyin. 

  2. 25 μL PerFix-nc Tampon 1 ekleyin. Pelet ayrılıncaya kadar vorteksleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. 

  3. 2 mL 1X PBS ekleyin. 5 dakika boyunca 200 x g’de vorteksleyin ve santrifüjleyin. Üst fazı aspire edin.  

  4. 25 μL Fetal Bovin Serum ekleyin. Peleti yeniden süspanse etmek için vorteksleyin. 

  5. 300 μL PerFix-nc Tampon 2 ekleyin. Vorteks. 

  6. İçeriğin tamamını DURAClone IF T Yardımcı Hücre Antikor Paneli'nin bir tüpüne aktarın.

  7. Tüpleri yüksek hızda 6-8 saniye boyunca vorteksleyin. Oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Işıktan koruyun.

  8. 3 mL PerFix-nc Tampon 3 ekleyin.

  9. 5 dakika boyunca 500 x g’de vorteksleyin ve santrifüjleyin. Üst fazı aspire edin. 

  10. Hücreleri 500 μL PerFix-nc Tampon 3 içinde yeniden süspanse edin. 

  11. Numune analize hazırdır. FS parametresindeki ayırıcıyı lenfositlerin edinmenin dışında bırakılmayacağını garanti etmek için yeterince düşük bir değere ayarlayın.

TELAFİ AYARLAMASI

  1. Kompenzasyon Kitindeki tek renkli tüplerin her birine 50 μL tam kan ekleyin. Tüm tüpler aynı torbadan olmalıdır.

  2. Aşağıdaki kompenzasyon tüplerine bir damla pozitif VersaComp Antikor Yakalama Boncuğu ekleyin:

    • IL4-PC7

  3. 6-8 saniye boyunca yüksek hızda vorteksleyin ve 18 ila 25 °C’de 15 dakika boyunca inkübe edin. Işıktan koruyun.

  4. Tam kan için ,6. adımı atlayarak Numune Hazırlığı işlemindeki 2-11. adımları izleyin.

  5. Kompenzasyon ayarı için standart işlemleri ve cihaz üreticisinin talimatlarını izleyin.

Analysis (Analiz)

  1. CD3-Alexa Flor 750 ile CD4-APC karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun. CD3+CD4+ hücrelerini kapsayacak bir bölge oluşturun.

  2. CD4+CD3+ geçitli hücrelerde sitokin üretimini aşağıdakiler yoluyla değerlendirin:

    • Alt kümeleri ayırt etmek için IFNγ-FITC ile IL4-PC7 karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği ve bir kadran geçidi oluşturma: IFNγ+ IL4-, IFNγ+ IL4+, IFNγ- IL4+ ve IFNγ- IL4- hücreleri.

    • IFNγ+ IL17a-, IFNγ+ IL17a+, IFNγ- IL17a+ ve IFNγ- IL17a- alt küme hücrelerini ayrıştırmak için IFNγ-FITC ile IL17a-Pasifik Mavi karşılaştırmasını içeren bir nokta grafiği ve kadran geçidi oluşturma.