DURAClone IM B Hücresi Protokolü
Bu protokol yalnızca referans amaçlıdır. Yöntemi belirli araştırma ihtiyaçları için uyarlama yapılması gerekebilir.
Malzemeler
KİT KUTUSU İÇERİĞİ
DURAClone IM B Hücresi Antikor Paneli için 25 test
3 Kompenzasyon Kiti, her kit sekiz adet tek renkli tüp içerir:
- CD4-FITC
- CD4-PE
- CD19-ECD
- CD27-PC7
- CD4-APC
- CD38-APC-Alexa Flor 750
- CD4-Pacific Blue
- CD8-Krome Orange
NOT: Reaktif tüplerini buzdolabında saklamayın, tüplere dondurma/çözdürme işlemi uygulamayın. Özellikle edinme öncesinde numunenin/numunelerin işlenmesi ve inkübasyonu sırasında tüplerin ışığa maruz kalmasını en aza indirin.
GEREKLİ OLAN ANCAK SAĞLANMAYAN MALZEME
Antikoagülan içeren kan toplama tüpü
Kalibre edilmiş pipetler
Vorteks mikser
VersaLyse Çözeltisi (Parça Numarası A09777)
IOTest 3 Fiksasyon Çözeltisi (Parça Numarası A07800)
Fosfat Tamponlu Salin, PBS (Parça Numarası 6603369 veya eşdeğeri)
- Kullanma Talimatına uygun olarak hazırlanmıştır.
1X PBS/Fiksatif:
- 12,5 μL IOTest®3 10X Konsantresine 1 mL 1X PBS eklenerek her gün taze hazırlanır. Her numune ve kompenzasyon kontrolü için 500 μL gerekir.
Aşağıdaki lazerler ve dedektörlerle donatılmış akış sitometrisi:
- FSC/SSC
- 405 nm: 430 – 470 nm ve 530 – 570 nm
- 488 nm: 504 – 545 nm, 560 – 600 nm, 605 – 635 nm, 680 – 710 nm ve >755 nm
- 633 nm: 650 – 670 nm, 715 – 735 nm ve >755 nm
Kılıf sıvısı
Akış sitometrisi kalibrasyon boncukları
Boyama İşlemi
NUMUNE HAZIRLIĞI
- 300 μL tam kana 10 mL 1X PBS ekleyin. Tüpü 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin; üst fazı aspire edin ve peletleri 10 mL 1X PBS içinde yeniden süspanse edin. 5 dakika boyunca tüpü tekrar 300 x g’da santrifüjleyin. Üst fazı aspire edin ve peletleri 300 μL 1X PBS'de yeniden süspanse edin.
- 100 μL yıkanmış tam kanı DURAClone IM B Hücre Antikor Panelinin bir tüpüne ekleyin.
- 6-8 saniye boyunca yüksek hızda vorteksleyin ve 20 ila 30 °C’de 15 dakika boyunca inkübe edin. Işıktan koruyun.
- 2 mL VersaLyse Çözeltisi ekleyin, 1-3 saniye boyunca yüksek hızda vorteksleyin ve 20 ila 30 °C’de 15 dakika boyunca inkübe edin. Işıktan koruyun.
- Tüpü 5 dakika boyunca 200 x g’de santrifüjleyin; üst fazı aspire edin. Peleti ayırmak için hafifçe vurun.
- 3 mL 1X PBS ekleyin; 5 dakika boyunca 200 x g’de santrifüjleyin. Üst fazı aspire edin. Peleti ayırmak için hafifçe vurun.
- Hücreleri 500 μL 1X PBS/Fiksasyon çözeltisinde yeniden süspanse edin.
- Numune, edinme için hazırdır. Lenfositler edinmeden hariç tutulmayacak şekilde FS parametresindeki ayırıcıyı ayarlayın.
TELAFİ AYARLAMASI
- Kompenzasyon Kitindeki tek renkli tüplerin her birine 100 μL tam kan ekleyin. Tüm tüpler aynı torbadan olmalıdır.
- Numune Hazırlığı işlemindeki 2-8. adımları izleyin.
- Kompenzasyon ayarı için standart işlemleri ve cihaz üreticisinin talimatlarını izleyin.
Analysis (Analiz)
- CD45-Krome Orange ile SSC karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve CD45+ lökositlerini kapsayacak bir bölge oluşturun
- CD19-ECD ile SSC karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve CD19+ hücrelerini kapsayacak bir bölge oluşturun. CD19+ hücreleri B hücreleridir
- Üç nokta grafiği oluşturun ve CD19+ geçidini üç grafiğin hepsine uygulayın:
- CD27-PC7 ile IgD-FITC karşılaştırması. IgD+ CD27- hücre popülasyonunda geçit oluşturmak için bir kadran çizin; bu saf B hücresi popülasyonudur. IgD+ CD27+ popülasyonunda geçit oluşturun; bunlar marjinal zon B hücreleridir.
- CD38-APC-Alexa Flor 750 ile CD21-PE karşılaştırması. CD21 düşük CD38 düşük hücre popülasyonunu belirtmek için bir kadran çizin.
- IgM-Pasifik Mavi ile IgD-FITC karşılaştırması. IgD-IgM-, IgD+IgM- , IgD+IgM+, IgD-IgM+ hücre popülasyonlarını belirtmek için bir kadran çizin.
- CD38-APC-Alexa Flor 750 ile CD27-PC7 karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve IgD-IgM- geçidini grafiğe uygulayın. Aşağıdakileri belirtmek için bir kadran çizin:
- a. IgD-IgM- CD38-CD27+popülasyonu. Bunlar sınıf geçişli bellek B hücreleridir.
- b. IgD-IgM- CD38-düşük CD27- popülasyonu
- c. IgD-IgM- CD38+ yüksek CD27- popülasyonu
- d. IgD-IgM-CD38+ yüksek CD27+ popülasyonu. Bunlar plazmablastlardır.
- Aşağıdaki nokta grafiklerini oluşturun ve IgD+IgM+ geçidini bunlara uygulayın:
- a. CD38-APC-Alexa Flor 750 ile CD27-PC7 karşılaştırması. Aşağıdakileri belirtmek için bir kadran ekleyin:
- 1) IgM+CD27-CD38 belirsiz popülasyon
- 2) IgM+CD27+CD38- popülasyonu: Bunlar sınıf geçişsiz bellek B hücreleridir.
- 3) IgM+CD27+ CD38+ yüksek popülasyon
- 4) IgM+ CD27-CD38- popülasyonu.
- b. CD24-APC ile CD38-APC-Alexa Flor 750 karşılaştırması yapın ve Boolean geçidi IgM-CD27-CD38 belirsiz VEYA IgM-CD27- CD38 yüksek uygulayarak geçiş B hücrelerini kapsayacak bir bölge çizin.
