DURAClone IM Dendritik Hücreler Protokolü
Bu protokol yalnızca referans amaçlıdır. Yöntemi belirli araştırma ihtiyaçları için uyarlama yapılması gerekebilir.
Malzemeler
KİT KUTUSU İÇERİĞİ
DURAClone IM Dendritik Hücre Antikor Paneli için 25 test
3 Kompenzasyon Kiti, her kit sekiz adet tek renkli tüp içerir:
- CD4-FITC
- CD4-PE
- CD1c-PC5.5
- CD11c-PC7
- CD4-APC
- CD123-APC-Alexa Flor 700
- CD4-Pacific Blue
- CD8-Krome Orange
NOT: Reaktif tüplerini buzdolabında saklamayın, tüplere dondurma/çözdürme işlemi uygulamayın. Özellikle edinme öncesinde numunenin/numunelerin işlenmesi ve inkübasyonu sırasında tüplerin ışığa maruz kalmasını en aza indirin.
GEREKLİ OLAN ANCAK SAĞLANMAYAN MALZEME
Antikoagülan içeren kan toplama tüpü
Kalibre edilmiş pipetler
Vorteks mikser
VersaLyse Çözeltisi (Parça Numarası A09777)
IOTest 3 Fiksasyon Çözeltisi (Parça Numarası A07800)
Fosfat Tamponlu Salin, PBS (Parça Numarası 6603369 veya eşdeğeri)
- Kullanma Talimatına uygun olarak hazırlanmıştır.
1X PBS/Fiksatif:
- 12,5 μL IOTest®3 10X Konsantresine 1 mL 1X PBS eklenerek her gün taze hazırlanır. Her numune ve kompenzasyon kontrolü için 500 μL gerekir.
VersaComp Antikor Yakalama Boncukları (Parça Numarası B22804)
Aşağıdaki lazerler ve dedektörlerle donatılmış akış sitometrisi:
- FSC/SSC
- 405 nm: 430 – 470 nm ve 530 – 570 nm
- 488 nm: 504 – 545 nm, 560 – 600 nm, 605 – 635 nm, 680 – 710 nm ve >755 nm
- 633 nm: 650 – 670 nm, 715 – 735 nm ve >755 nm
Kılıf sıvısı
Akış sitometrisi kalibrasyon boncukları
Boyama İşlemi
NUMUNE HAZIRLIĞI
- DURAClone IM Dendritik Hücreler Antikor Panelinin bir tüpüne 200 μL tam kan ekleyin.
- 6-8 saniye boyunca yüksek hızda vorteksleyin ve 20 ila 30 °C’de 15 dakika boyunca inkübe edin. Işıktan koruyun.
- 2 mL VersaLyse ekleyin, 1-3 saniye boyunca yüksek hızda vorteksleyin ve 20 - 30 °C arasında 15 dakika inkübe edin. Işıktan koruyun.
- Tüpü 5 dakika boyunca 200 x g’de santrifüjleyin; üst fazı aspire edin. Peleti ayırmak için hafifçe vurun.
- 3 mL 1X PBS ekleyin; 5 dakika boyunca 200 x g’de santrifüjleyin. Üst fazı aspire edin. Peleti ayırmak için hafifçe vurun.
- Hücreleri 500 μL 1X PBS/Fiksasyon çözeltisinde yeniden süspanse edin.
- Numune analize hazırdır.
TELAFİ AYARLAMASI
- Kompenzasyon Kitindeki tek renkli tüplerin her birine 100 μL tam kan ekleyin. Tüm tüpler aynı torbadan olmalıdır.
- Aşağıdaki kompenzasyon tüplerinin pozitif VersaComp Antikor Yakalama Boncuklarından bir damla ekleyin:
- CD1c-PC5.5
- CD123-APC-Alexa Flor 700
- Numune Hazırlığı işlemindeki 2-7. adımları izleyin.
- Kompenzasyon ayarı için standart işlemleri ve cihaz üreticisinin talimatlarını izleyin.
