DURAClone IM Granülosit Protokolü

Bu protokol yalnızca referans amaçlıdır.  Yöntemi belirli araştırma ihtiyaçları için uyarlama yapılması gerekebilir.

Malzemeler

KİT KUTUSU İÇERİĞİ

DURAClone IM Granülosit Antikor Paneli için 25 test

3 Kompenzasyon Kiti, her kit dokuz tek renkli tüp içerir:

  • CD4-FITC
  • CD16-ECD
  • CD33-PC5.5
  • CD11b-PC7
  • CD4-APC
  • CD19-APC-Alexa Flor 700
  • CD62L-APC-Alexa Flor 750
  • CD4-Pacific Blue
  • CD8-Krome Orange

NOT: Reaktif tüplerini buzdolabında saklamayın, tüplere dondurma/çözdürme işlemi uygulamayın. Özellikle edinme öncesinde numunenin/numunelerin işlenmesi ve inkübasyonu sırasında tüplerin ışığa maruz kalmasını en aza indirin.

GEREKLİ OLAN ANCAK SAĞLANMAYAN MALZEME

Antikoagülan, K2 EDTA içeren kan toplama tüpü

Kalibre edilmiş pipetler

Vorteks mikser

VersaLyse Çözeltisi (Parça Numarası A09777)

IOTest 3 Fiksasyon Çözeltisi (Parça Numarası A07800)

VersaLyse Fix-and-Lyse Karışımı:

  • 1 mL of VersaLyse Çözeltisine 25 μL 10X IOTest 3 Fiksasyon Çözeltisi eklenerek her gün taze hazırlanır. Her numune ve kompenzasyon kontrolü için 2 mL gerekir.

Fosfat Tamponlu Salin, PBS (Parça Numarası 6603369 veya eşdeğeri)

  •  Kullanma Talimatına uygun olarak hazırlanmıştır.

1X PBS/Fiksatif:

  • 12,5 μL IOTest®3 10X Konsantresine 1 mL 1X PBS eklenerek her gün taze hazırlanır. Her numune ve kompenzasyon kontrolü için 500 μL gerekir.

VersaComp Antikor Yakalama Boncukları (Parça Numarası B22804)

Aşağıdaki lazerler ve dedektörlerle donatılmış akış sitometrisi:

  • FSC/SSC
  • 405 nm: 430 – 470 nm ve 530 – 570nm
  • 488 nm: 504 – 545 nm, 605 – 635 nm, 680 – 710 nm ve >755nm
  • 633 nm: 650 – 670 nm, 715 – 735 nm ve >755 nm

Kılıf sıvısı

Akış sitometrisi kalibrasyon boncukları

Boyama İşlemi

NUMUNE HAZIRLIĞI

  1. DURAClone IM Granülositler Antikor Panelinin bir tüpüne 100 μL tam kan ekleyin.

  2. 6-8 saniye boyunca yüksek hızda vorteksleyin ve 18 ila 25 °C’de 15 dakika boyunca inkübe edin. Işıktan koruyun.

  3. 2 mL VersaLyse Fix-and-Lyse Karışımı ekleyin. 1-3 saniye boyunca yüksek hızda vorteksleyin ve 18 ila 25 °C’de 15 dakika boyunca inkübe edin. Işıktan koruyun.

  4. Tüpü 5 dakika boyunca 200 x g’de santrifüjleyin; üst fazı aspire edin. Peleti ayırmak için yüksek hızda 1-3 saniye vorteksleyin.

  5. 3 mL 1X PBS ekleyin; 5 dakika boyunca 200 x g’de santrifüjleyin. Üst fazı aspire edin. Peleti ayırmak için yüksek hızda 1-3 saniye vorteksleyin.

  6. Hücreleri 500 μL 1X PBS/Fiksasyon çözeltisinde yeniden süspanse edin.

  7. Numune analize hazırdır.

TELAFİ AYARLAMASI

  1. Kompenzasyon Kitindeki tek renkli tüplerin her birine 100 μL tam kan ekleyin. Tüm tüpler tek bir torbadan alınmış olmalıdır.

  2. Aşağıdaki kompenzasyon tüplerine bir damla pozitif VersaComp Antikor Yakalama Boncuğu ekleyin:

    • CD16-ECD

    • CD33-PC5.5

    • CD11b-PC7

    • CD19-APC-Alexa Flor 700

    • CD62L-APC-Alexa Flor 750

  3. Numune Hazırlığı işlemindeki 2-7. adımları izleyin.  

  4. Kompenzasyon ayarı için standart işlemleri ve cihaz üreticisinin talimatlarını izleyin.

Analysis (Analiz)

  1. Olası tekrarları ortadan kaldırmak için FS INT ile FS PEAK karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği ve tekli bir geçit oluşturun (çapraz popülasyonlarla çakışmayan değerlerle tanımlanır).

  2. FSC ile SSC karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve tekli geçit uygulayın. Kalıntıları hariç tutmak için bir bölge oluşturun (saçılım geçidi)

  3. Lineage (CD3-, CD19-, CD14-, CD56-APC-Alexa Flor 700) ile CD294-FITC karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve saçılım geçidini uygulayın. CD294+ Lineage- hücrelerini kapsayacak bir bölge oluşturun. Bir Boolean geçidi NOT(CD294+Lin-) oluşturun.

  4. CD15-Pasifik Mavi ile SSC karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve CD294+ geçidini uygulayın. CD15+SSCyüksek geçit (Eozinofiller) ve CD15-SSCdüşük geçit (Bazofiller) oluşturun.

  5. Lineage ile CD15-PBE karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve NOT(CD294+Tür-) geçidini uygulayın. CD15+ Lineage hücrelerini kapsayacak bir bölge oluşturun: CD15+. Bir Boolean geçidi NOT(CD15+Lineage-) oluşturun.

  6. Bir Boolean geçidi oluşturun: Tüm granülositler = CD15+ VEYA (Eozinofiller VEYA Bazofiller). CD62L-APC-Alexa Flor 750 ile CD16-ECD karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği ve CD274-APC ile CD11b- PC7 karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve Tüm granülosit geçitlerini uygulayın.

  7. Lin ile CD33-PC5.5 karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve bir Boolean geçidi (CD294+ DEĞİL) VE (CD15+ DEĞİL) uygulayın ve hücreleri kapsayacak bir bölge oluşturun. CD33+ bölgesini adlandırın.

  8. CD45-Krome Orange ile CD33-PC5.5 karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve CD33+ geçidini uygulayın. Aykırı değerleri merkezi popülasyonun dışında tutmak için hücreleri kapsayacak bir bölge oluşturun. Mono bölgesini adlandırın.

  9. CD16-ECD ile Lineage karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve Mono geçidi uygulayın. Klasik monositleri, klasik olmayan monositleri, CD14dimCD16- monositlerini ve monosit ve granülositlerin tekrarlarını kapsayacak bölgeler oluşturun.