DURAClone IM Fenotipleme Temel Protokolü

Bu protokol yalnızca referans amaçlıdır.  Yöntemi belirli araştırma ihtiyaçları için uyarlama yapılması gerekebilir.

Malzemeler

KİT KUTUSU İÇERİĞİ

DURAClone IM Fenotipleme Temel Antikor Paneli için 25 test

3 Kompenzasyon Kiti, her kit sekiz adet tek renkli tüp içerir:

  • CD4-FITC
  • CD4-PE
  • CD19-ECD
  • CD14-PC7
  • CD4-APC
  • CD8-Alexa Flor 700
  • CD3-APC-Alexa Flor 750
  • CD8-Krome Orange

NOT: Reaktif tüplerini buzdolabında saklamayın, tüplere dondurma/çözdürme işlemi uygulamayın. Özellikle edinme öncesinde numunenin/numunelerin işlenmesi ve inkübasyonu sırasında tüplerin ışığa maruz kalmasını en aza indirin.

GEREKLİ OLAN ANCAK SAĞLANMAYAN MALZEME

Antikoagülan içeren kan toplama tüpü

Kalibre edilmiş pipetler

Vorteks mikser

VersaLyse Çözeltisi (Parça Numarası A09777)

IOTest 3 Fiksasyon Çözeltisi (Parça Numarası A07800)

Fosfat Tamponlu Salin, PBS (Parça Numarası 6603369 veya eşdeğeri)

  • Kullanma Talimatına uygun olarak hazırlanmıştır.

1X PBS/Fiksatif:

  • 12,5 μL IOTest®3 10X Konsantresine 1 mL 1X PBS eklenerek her gün taze hazırlanır. Her numune ve kompenzasyon kontrolü için 500 μL gerekir.

Aşağıdaki lazerler ve dedektörlerle donatılmış akış sitometrisi:

  • FSC/SSC
  • 405 nm: 430 – 470 nm ve 530 – 570 nm
  • 488 nm: 504 – 545 nm, 560 - 600 nm, 605 – 635 nm, 680 – 710 nm ve >755 nm
  • 633 nm: 650 – 670 nm, 715 – 735 nm ve >755 nm

Kılıf sıvısı

Akış sitometrisi kalibrasyon boncukları

Boyama İşlemi

NUMUNE HAZIRLIĞI

  1. DURAClone IM Fenotipleme Temel Antikor Panelinin bir tüpüne 100 μL tam kan ekleyin.

  2. 6-8 saniye boyunca yüksek hızda vorteksleyin ve 20 ila 30 °C’de 15 dakika boyunca inkübe edin. Işıktan koruyun.

  3. 2 mL VersaLyse ekleyin, 1-3 saniye boyunca yüksek hızda vorteksleyin ve tüpü 20 ila 30 °C arasında 15 dakika inkübe edin. Işıktan koruyun.

  4. Tüpü 5 dakika boyunca 200 x g’de santrifüjleyin; üst fazı aspire edin. Peleti ayırmak için hafifçe vurun.

  5. 3 mL 1X PBS ekleyin; 5 dakika boyunca 200 x g’de santrifüjleyin. Üst fazı aspire edin. Peleti ayırmak için hafifçe vurun.

  6. Hücreleri 500 μL 1X PBS/Fiksasyon çözeltisinde yeniden süspanse edin. 

  7. Numune, edinme için hazırdır. Lenfositler edinmeden hariç tutulmayacak şekilde FS parametresindeki ayırıcıyı ayarlayın.

TELAFİ AYARLAMASI

  1. Kompenzasyon Kitindeki tek renkli tüplerin her birine 100 μL tam kan ekleyin. Tüm tüpler aynı torbadan olmalıdır.

  2. Numune Hazırlığı işlemindeki 2-7. adımları izleyin.  

  3. Kompenzasyon ayarı için standart işlemleri ve cihaz üreticisinin talimatlarını izleyin. 

Analysis (Analiz)

  1. CD45-Krome Orange ile SSC karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve CD45+ lökositlerini kapsayacak bir bölge oluşturun.

  2. Aşağıdaki şekilde üç grafik oluşturun:

    • CD14- PC7 ile SSC karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve CD45+lökosit geçidini bu grafiğe uygulayın ve CD14+ hücrelerini kapsayacak bir bölge çizin. Bu hücreler monositlerdir.

    • CD19- ECD ile CD3-APC-Alexa Flor 750 karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve CD19+ hücrelerini kapsayacak bir bölge çizin. Bu hücreler B lenfositleridir.

    • CD56-PE ile CD3-APC-Alexa Flor 750 karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun. "Lenfositler VE (CD19+ DEĞİL)" Boolean geçidi oluşturun ve bu geçidi uygulayın. CD56+ ve CD3+ hücre popülasyonlarını kapsayacak bir bölge çizin. CD56+ ve CD3+ hücre popülasyonlarını kapsayacak bir bölge olarak çizin. CD56+ hücreleri Doğal Öldürücü hücreler iken, CD3+ hücreleri T lenfositleridir (T hücreleri).

  3. CD56-PE ile CD16-FITC karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun.

    • CD56-PE ile CD3-APC-Alexa Flor 750 karşılaştırmasına ait bir nokta grafiğinden CD56+ geçidini uygulayın.

    • CD56+ yüksek NK hücrelerini kapsayacak bir bölge çizin.

  4. CD4-APC ile CD8-Alexa Flor 700 karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun.

    • Geçidi CD56- PE ile CD3- APC-Alexa Flor 750 karşılaştırmasına ait bir nokta grafiğinden CD3+ T hücre geçidine uygulayın.

    • CD4+ T hücrelerini kapsayacak bir bölge ve CD8+ T hücrelerini kapsayacak başka bir bölge çizin.

  5. CD16-FITC ile CD14-PC7 karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun.

    • CD14+ geçidini bu grafiğe uygulayın.

    • Aşağıdaki hücre popülasyonlarını kapsayacak bölgeleri ekleyin:

      • CD 14+ yüksek CD16- monositleri

      • CD14 + yüksek CD16+ monositleri

      • CD14+ CD16 yüksek monositler

  6. Tüm geçitli hücre popülasyonlarının istenen istatistiklerini kaydedin.