DURAClone IM TCR Protokolü

Bu protokol yalnızca referans amaçlıdır.  Yöntemi belirli araştırma ihtiyaçları için uyarlama yapılması gerekebilir.

Malzemeler

KİT KUTUSU İÇERİĞİ

DURAClone IM TCR Antikor Paneli için 25 test

3 Kompenzasyon Kiti, her kit dokuz tek renkli tüp içerir:

  • CD4-FITC
  • CD4-PE
  • HLA-DR-ECD
  • VD1-PC7
  • CD4-APC
  • CD8-Alexa Flor 700
  • CD3-APC-Alexa Flor 750
  • CD4-Pacific Blue
  • CD8-Krome Orange

NOT: Reaktif tüplerini buzdolabında saklamayın, tüplere dondurma/çözdürme işlemi uygulamayın. Özellikle edinme öncesinde numunenin/numunelerin işlenmesi ve inkübasyonu sırasında tüplerin ışığa maruz kalmasını en aza indirin.

GEREKLİ OLAN ANCAK SAĞLANMAYAN MALZEME

Antikoagülan, K2 EDTA içeren kan toplama tüpü

Kalibre edilmiş pipetler

Vorteks mikser

VersaLyse Çözeltisi (Parça Numarası A09777)

IOTest 3 Fiksasyon Çözeltisi (Parça Numarası A07800)

Fosfat Tamponlu Salin, PBS (Parça Numarası 6603369 veya eşdeğeri)

  •  Kullanma Talimatına uygun olarak hazırlanmıştır.

1X PBS/Fiksatif:

  • 100 μL IOTest®3 10X Konsantresine 900 μL 1X PBS eklenerek her gün taze hazırlanır. Her numune ve kompenzasyon kontrolü için 500 μL gerekir.

VersaComp Antikor Yakalama Boncukları (Parça Numarası B22804)

Aşağıdaki lazerler ve dedektörlerle donatılmış akış sitometrisi:

  • FSC/SSC
  • 405 nm: 430 – 470 nm ve 530 – 570 nm
  • 488 nm: 504 – 545 nm, 560 – 600 nm, 605 – 635 nm, 680 – 710 nm ve >755 nm
  • 633 nm: 650 – 670 nm, 715 – 735 nm ve >755 nm

Kılıf sıvısı

Akış sitometrisi kalibrasyon boncukları

Boyama İşlemi

NUMUNE HAZIRLIĞI 

  1. DURAClone IM TCR Antikor Panelinin bir tüpüne 100 μL tam kan ekleyin.

  2. 6-8 saniye boyunca yüksek hızda vorteksleyin ve 20 ila 30 °C’de 15 dakika boyunca inkübe edin. Işıktan koruyun.

  3. 2 mL VersaLyse ekleyin, 1-3 saniye boyunca yüksek hızda vorteksleyin ve 20 ila 30 °C’de 15 dakika boyunca inkübe edin. Işıktan koruyun.

  4. Tüpü 5 dakika boyunca 200 x g’de santrifüjleyin; üst fazı aspire edin. Peleti ayırmak için hafifçe vurun.

  5. 3 mL 1X PBS ekleyin; tüpü 5 dakika boyunca 200 x g’de santrifüjleyin. Üst fazı aspire edin.

  6. Hücreleri 500 μL 1X PBS/Fiksasyon çözeltisinde yeniden süspanse edin.

  7. Numune, edinme için hazırdır. FS parametresindeki ayırıcıyı lenfositlerin edinmenin dışında bırakılmayacağını garanti etmek için yeterince düşük bir değere ayarlayın.

TELAFİ AYARLAMASI

  1. Kompenzasyon Kitindeki tek renkli tüplerin her birine 100 μL tam kan ekleyin. Tüm tüpler aynı torbadan olmalıdır.

  2. Aşağıdaki kompenzasyon tüpüne pozitif VersaComp Antikor Yakalama Boncuklarından iki damla ekleyin:

    • VD1-PC7

  3. Numune Hazırlığı işlemindeki 2-7. adımları izleyin.

  4. Kompenzasyon ayarı için standart işlemleri ve cihaz üreticisinin talimatlarını izleyin.

Analysis (Analiz)

  1. CD45-Krome Orange ile SSC karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve lökosit geçidini uygulayın. CD45+ lenfositlerini kapsayacak bir bölge oluşturun.

  2. CD3-APC-Alexa Flor 750 ile SSC karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve CD3+ T hücrelerinde geçit oluşturmak için bir bölge çizin.

  3. Aşağıdaki nokta grafiklerini oluşturun ve CD3+ geçidini bu grafiklere uygulayın:

    • HLA-DR-ECD ile SSC karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve HLA-DR+ popülasyonunda geçit oluşturun.

    • CD4-APC ile CD8-Alexa Flor 700 karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve sırasıyla CD4+ T hücrelerinde ve CD8+ T hücrelerinde geçit oluşturmak için iki bölge çizin.

    • TCR γδ –FITC ile TCR αβ –PE karşılaştırmasına ait bir grafik oluşturun ve TCR γδ + T hücrelerinde ve TCR αβ + T hücrelerinde geçit oluşturun.

  4. VD1-PC7 (yani TCR Vδ1) ile VD2-PB (i.e. TCR Vδ2) karşılaştırmasına ait bir grafik oluşturun, TCR γδ + T hücre geçidini bu grafiğe uygulayın ve TCR Vδ1 + T hücrelerini ve TCR Vδ2+ T hücrelerini tanımlayın.

  5. CD4-APC ile CD8-Alexa Flor 700 karşılaştırmasına ait bir grafik oluşturun, TCR αβ + T hücreleri geçidini bu grafiğe uygulayın ve TCR αβ + CD8+ T hücrelerini ve TCR αβ + CD4+ T hücrelerini tanımlayın.