DURAClone IM Treg Protokolü

Bu protokol yalnızca referans amaçlıdır.  Yöntemi belirli araştırma ihtiyaçları için uyarlama yapılması gerekebilir.

Malzemeler

KİT KUTUSU İÇERİĞİ

DURAClone IM Treg Antikor Paneli için 25 test:

  • Tüp 1
  • Tüp 2

3 Kompenzasyon Kiti, her kit sekiz adet tek renkli tüp içerir:

  • CD4-FITC
  • CD4-PE
  • CD39-PC5.5
  • CD4-PC7
  • FoxP3-Alexa Flor 647
  • CD3-APC-Alexa Flor 750
  • CD4-Pacific Blue
  • CD8-Krome Orange

NOT: Reaktif tüplerini buzdolabında saklamayın, tüplere dondurma/çözdürme işlemi uygulamayın. Özellikle edinme öncesinde numunenin/numunelerin işlenmesi ve inkübasyonu sırasında tüplerin ışığa maruz kalmasını en aza indirin.

GEREKLİ OLAN ANCAK SAĞLANMAYAN MALZEME

Antikoagülan, K2 EDTA içeren kan toplama tüpü

Kalibre edilmiş pipetler

Vorteks mikser

PerFix-nc Hücresel Boyama Hazırlama Kiti (Parça Numarası B10825):

  • Tampon 1, fiksatif reaktif
  • Tampon 2, permeabilizan reaktif
  • Tampon 3, nihai çözelti, 10X konsantre.  Kullanmadan önce 1X'e seyreltin.

Fosfat Tamponlu Salin, PBS (Parça Numarası 6603369 veya eşdeğeri)

  •  Kullanma Talimatına uygun olarak hazırlanmıştır.

Fetal Sığır Serumu

VersaComp Antikor Yakalama Boncuğu Kiti (Parça Numarası B22804)

Aşağıdaki lazerler ve dedektörlerle donatılmış akış sitometrisi:

  • FSC/SSC
  • 405 nm: 430 – 470 nm ve 530 – 570 nm
  • 488 nm: 504 – 545 nm, 560 – 600 nm, 605 – 635 nm, 680 – 710 nm ve >755 nm
  • 633 nm: 650 – 670 nm, 715 – 735 nm ve >755 nm

Kılıf sıvısı

Akış sitometrisi kalibrasyon boncukları

Boyama İşlemi

NUMUNE HAZIRLIĞI 

  1. DURAClone IM Treg Tüpü 1’in bir tüpüne 50 μL tam kan ekleyin.

  2. 6-8 saniye boyunca yüksek hızda vorteksleyin ve 20 ila 30 °C’de 15 dakika boyunca inkübe edin. Işıktan koruyun.

  3. 3 mL 1X PBS ekleyin; 5 dakika boyunca 500 x g’de santrifüjleyin. Üst fazı aspire edin. Peleti ayırmak için nazikçe vorteksleyin.

  4. Hücreleri 50 μL %100 fetal buzağı serumunda yeniden süspanse edin.

  5. 5 μL PerFix-nc Tampon 1 ekleyin ve yüksek hızda 6-8 saniye vorteksleyin.

  6. Tüp 1’i 15 dakika boyunca 20 ile 30 °C’de inkübe edin. Işıktan koruyun.

  7. 400 μL PerFix nc Tampon 2 ekleyin ve yüksek hızda 6-8 saniye vorteksleyin.

  8. Tüp 1'in içindekileri DURAClone IM Treg Tüpü 2'ye aktarın.

  9. Yüksek hızda 6-8 saniye vorteksleyin. 60 dakika boyunca 20 ile 30 °C’de inkübe edin. Işıktan koruyun.

  10. 3 mL 1X PBS ekleyin ve 5 dakika boyunca 20 ila 30 °C’de inkübe edin. Işıktan koruyun.

  11. Tüpü 5 dakika boyunca 20 ila 30 °C’de 500 x g’de santrifüjleyin. Üst faza aspirasyon uygulayın. Peleti ayırmak için nazikçe vorteksleyin.

  12. Hücreleri 3 mL 1X PerFix-nc Tampon 3 içinde yeniden süspanse edin.

  13. Tüpü 5 dakika boyunca 20 ila 30 °C’de 500 x g’de santrifüjleyin. Üst faza aspirasyon uygulayın. Peleti ayırmak için nazikçe vorteksleyin.

  14. Hücreleri 500 μL PerFix-nc Tampon 3 içinde yeniden süspanse edin.

  15. Numune, edinme için hazırdır. FS parametresindeki ayırıcıyı lenfositlerin edinmenin dışında bırakılmayacağını garanti etmek için yeterince düşük bir değere ayarlayın.

TELAFİ AYARLAMASI

  1. Kompenzasyon Kitindeki tek renkli tüplerin her birine 50 μL tam kan ekleyin.  Tüm tüpler tek bir torbadan alınmış olmalıdır.

  2. Aşağıdaki kompenzasyon tüplerine pozitif VersaComp Antikor Yakalama Boncuklarından iki damla ekleyin:

    • CD39-PC5.5

    • FoxP3-Alexa Flor 647

  3. 8. adımı atlayarak Numune Hazırlığı işlemindeki 2-15. adımları izleyin.

  4. Kompenzasyon ayarı için standart işlemleri ve cihaz üreticisinin talimatlarını izleyin.

Analysis (Analiz)

  1. CD45-Krome Orange ile SSC karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve lökosit geçidini uygulayın. CD45+ lenfositlerini kapsayacak bir bölge oluşturun.

  2. CD4-PC7 ile CD3-APC-Alexa Flor 750 karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve CD3+CD4+ T hücrelerinde geçit oluşturmak için bir bölge çizin.

  3. Aşağıdaki nokta grafiklerini oluşturun ve CD3+CD4+ geçidini bu grafiklere uygulayın:

    • CD4-PC7 ile CD25-PE karşılaştırmasına ait bir grafik oluşturun ve CD4+CD25+ popülasyonunda geçit oluşturun.

    • CD4-PC7 ile FoxP3-Alexa Flor 647 karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve CD4+FoxP3+ popülasyonunda geçit oluşturun.

    • CD4-PC7 ile Helios-Pasifik Mavi karşılaştırmasına ait bir grafik oluşturun ve CD4+ Helios+ popülasyonunda geçit oluşturun.

    • CD4-PC7 ile CD39-PC5.5 karşılaştırmasına ait bir grafik oluşturun ve CD4+CD39+ popülasyonunda geçit oluşturun.

    • CD4-PC7 ile CD45RA-FITC karşılaştırmasına ait bir grafik oluşturun ve CD4+CD45RA+ popülasyonunda geçit oluşturun.

    • FoxP3-Alexa Flor 647 ile Helios-Pasifik Mavi karşılaştırmasına ait bir grafik oluşturun ve FoxP3+Helios+ popülasyonunda geçit oluşturun.