DURAClone RE ALB Protokolü

Bu protokol yalnızca referans amaçlıdır.  Yöntemi belirli araştırma ihtiyaçları için uyarlama yapılması gerekebilir.

Malzemeler

KİT KUTUSU İÇERİĞİ

DURAClone RE ALB Antikor Paneli için 25 test

3 Kompenzasyon Kiti, her kit sekiz adet tek renkli tüp içerir:

  • CD4-FITC
  • CD34-ECD
  • CD10-PC5.5
  • CD19-PC7
  • CD38-APC-Alexa Flor 700
  • CD20-APC-Alexa Flor 750
  • CD8-Krome Orange

NOT: Reaktif tüplerini buzdolabında saklamayın, tüplere dondurma/çözdürme işlemi uygulamayın. Özellikle edinme öncesinde numunenin/numunelerin işlenmesi ve inkübasyonu sırasında tüplerin ışığa maruz kalmasını en aza indirin.

GEREKLİ OLAN ANCAK SAĞLANMAYAN MALZEME

Antikoagülan, K2 EDTA içeren kan toplama tüpü

Kalibre edilmiş pipetler

Vorteks mikser

VersaLyse Çözeltisi (Parça Numarası A09777)

IOTest 3 Fiksasyon Çözeltisi (Parça Numarası A07800)

VersaLyse Fix-and-Lyse Karışımı:

  • 1 mL of VersaLyse Çözeltisine 25 μL 10X IOTest 3 Fiksasyon Çözeltisi eklenerek her gün taze hazırlanır. Her numune ve kompenzasyon kontrolü için 2 mL gerekir.

Fosfat Tamponlu Salin, PBS (Parça Numarası 6603369 veya eşdeğeri)

  •  Kullanma Talimatına uygun olarak hazırlanmıştır.

1X PBS/Fiksatif:

  • 12,5 μL IOTest®3 10X Konsantresine 1 mL 1X PBS eklenerek her gün taze hazırlanır. Her numune ve kompenzasyon kontrolü için 500 μL gerekir.

VersaComp Antikor Yakalama Boncukları (Parça Numarası B22804)

Aşağıdaki lazerler ve dedektörlerle donatılmış akış sitometrisi:

  • FSC/SSC
  • 405 nm: 430 – 470 nm ve 530 – 570 nm
  • 488 nm: 504 – 545 nm, 560 – 600 nm, 605 – 635 nm, 680 – 710 nm ve >755 nm
  • 633 nm: 650 – 670 nm, 715 – 735 nm ve >755 nm

Kılıf sıvısı

Akış sitometrisi kalibrasyon boncukları

Boyama İşlemi

NUMUNE HAZIRLIĞI 

  1. Kemik iliği numunelerindeki toplam lökosit sayısını belirleyin.

  2. 1,5 ila 2,0 milyon lökosite eşdeğer numune hacmini boş bir tüpe aktarın.

  3. 100 μL kemik iliği hücresi başına 2 mL VersaLyse Fix-and-Lyse Karışımı ekleyin. Tüpü 1-3 saniye boyunca yüksek hızda vorteksleyin ve tüpü 18 ila 25 °C’de 15 dakika boyunca inkübe edin. Işıktan koruyun.

  4. Tüpü 5 dakika boyunca 300 x g’de santrifüjleyin; üst fazı aspire edin. Peleti ayırmak için hafifçe vurun.

  5. 100 μL PBS ekleyin ve DURAClone RE ALB kurutulmuş reaktif tüpüne aktarın. 6-8 saniye boyunca yüksek hızda vorteksleyin ve 18 ila 25 °C’de 15 dakika boyunca inkübe edin. Işıktan koruyun.

  6. 3 mL 1X PBS ekleyin;  5 dakika boyunca 200 x g’de santrifüjleyin; üst fazı aspire edin.

  7. Hücreleri 500 μL 1X PBS/Fiksasyon çözeltisinde yeniden süspanse edin.

  8. Örnek artık analize hazırdır.

TELAFİ AYARLAMASI

  1. Boş polipropilen tüpe 800 μL tam kan ekleyin ve Numune Hazırlığı işlemindeki 3-4. adımları izleyerek işleyin.

  2. 3 mL 1X PBS ekleyin; 5 dakika boyunca 300 x g’de santrifüjleyin; üst fazı aspire edin. Hücre peletini 800 μL 1X  PBS içinde yeniden süspanse edin.

  3. Kompenzasyon Kitindeki tek renkli tüplerin her birine 100 μL ekleyin.  Tüm tüpler aynı torbadan olmalıdır.

  4. Aşağıdaki kompenzasyon tüplerine bir damla pozitif VersaComp Antikor Yakalama Boncuğu ekleyin:

    • CD34-ECD
    • CD10-PC5.5
    • CD19-PC7
    • CD38-APC-Alexa Flor 700
    • CD20-APC-Alexa Flor 750

  5. 6-8 saniye boyunca yüksek hızda vorteksleyin ve 20 ila 30 °C’de 15 dakika boyunca inkübe edin. Işıktan koruyun.

  6. Numune Hazırlığı işlemindeki 6-8. adımları izleyin.

  7. Kompenzasyon ayarı için standart işlemleri ve cihaz üreticisinin talimatlarını izleyin.

Analysis (Analiz)

  1. Olası tekrarları ortadan kaldırmak için FS INT ile FS TOF karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği ve bir tekli geçit oluşturun (SFS TOF'ta daha yüksek değerlerle tanımlanır)

  2. FSC ile SSC karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve tekli geçit uygulayın. FS parametresindeki ayırıcıyı lenfositlerin edinmenin dışında bırakılmayacağını garanti etmek için yeterince düşük bir değere ayarlayın.

  3. CD45-Krome Orange ile SSC karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve saçılım geçidini uygulayın.

  4. CD19-PC7 ile SSC karşılaştırmasını içeren bir nokta grafiği oluşturun. CD19+ düşük SSC hücrelerini çevreleyen bir bölge çizin.

  5. CD34-ECD ile CD38-APC-Alexa Flor 700 karşılaştırmasını içeren bir nokta grafiği oluşturun adım 5’teki geçidi uygulayın. CD38-APC-Alexa Flor 700 dim/+ CD34+ hücreleri kapsayacak bir bölge oluşturun.

  6. CD10-PC5.5 ile CD20-APC-Alexa Flor 750 karşılaştırmasını içeren bir nokta grafiği oluşturun adım 5’teki geçidi uygulayın. CD20-APC-Alexa Flor 750 dim/-ve+ CD10+ hücreleri kapsayacak bir bölge oluşturun

  7. CD10-PC5.5 ile CD58-FITC karşılaştırmasını içeren bir nokta grafiği oluşturun adım 5’teki geçidi uygulayın. CD58+ CD10+ hücrelerini kapsayacak bir bölge oluşturun.

  8. Adım 6, 7 ve 8'deki tüm geçitleri kapsayan bir Boolean VE geçidi oluşturun. Boolean geçidini “Nadir B hücreleri” olarak etiketleyin.

  9. CD45-Krome Orange ile CD19-PC7 karşılaştırmasını içeren bir nokta grafiği oluşturun ve “Nadir B hücreleri” geçidini uygulayın. CD19+ CD45 belirsiz popülasyonuna bir geçit çizin ve geçidi “Anormal B projenitörleri” olarak etiketleyin.

  10. CD10-PC5.5 ile CD34-ECD karşılaştırmasını içeren bir nokta grafiği oluşturun. Bu grafiğe “Anormal B projenitörleri” geçidini uygulayın.

  11. Geçitli CD34+ CD38+ CD10+ CD58+ B hücreleri üzerindeki belirtecin immünofenotip ekspresyonunu analiz etmek için yukarıdaki geçitleri kullanın.