DURAClone RE CLB Protokolü

Bu protokol yalnızca referans amaçlıdır.  Yöntemi belirli araştırma ihtiyaçları için uyarlama yapılması gerekebilir.

Malzemeler

KİT KUTUSU İÇERİĞİ

DURAClone RE CLB Antikor Paneli için 25 test

3 Kompenzasyon Kiti, her kit sekiz adet tek renkli tüp içerir:

  • CD4-FITC
  • CD4-PE
  • CD79b-PC5.5
  • CD19-PC7
  • CD4-APC
  • CD43-APC-Alexa Flor 750
  • CD4-Pacific Blue
  • CD8-Krome Orange

NOT: Reaktif tüplerini buzdolabında saklamayın, tüplere dondurma/çözdürme işlemi uygulamayın. Özellikle edinme öncesinde numunenin/numunelerin işlenmesi ve inkübasyonu sırasında tüplerin ışığa maruz kalmasını en aza indirin.

GEREKLİ OLAN ANCAK SAĞLANMAYAN MALZEME

Antikoagülan, K2 EDTA veya K3 EDTA içeren kan toplama tüpü

Kalibre edilmiş pipetler

Vorteks mikser

VersaLyse Çözeltisi (Parça Numarası A09777)

IOTest 3 Fiksasyon Çözeltisi (Parça Numarası A07800).

VersaLyse Fix-and-Lyse Karışımı:

  • 1 mL of VersaLyse Çözeltisine 25 μL 10X IOTest 3 Fiksasyon Çözeltisi eklenerek her gün taze hazırlanır. Her numune için 3 mL ve kompenzasyon kontrolü için 1 mL gerekir.

Fosfat Tamponlu Salin, PBS (Parça Numarası 6603369 veya eşdeğeri)

  •  Kullanma Talimatına uygun olarak hazırlanmıştır.

1X PBS/Fiksatif:

  • 12,5 μL IOTest®3 10X Konsantresine 1 mL 1X PBS eklenerek her gün taze hazırlanır. Her numune ve kompenzasyon kontrolü için 500 μL gerekir.

VersaComp Antikor Yakalama Boncukları (Parça Numarası B22804) 

Aşağıdaki lazerler ve dedektörlerle donatılmış akış sitometrisi:

  • FSC/SSC
  • 405 nm: 430 – 470 nm ve 530 – 570 nm
  • 488 nm: 504 – 545 nm, 560 – 600 nm, 605 – 635 nm, 680 – 710 nm ve >755 nm
  • 633 nm: 650 – 670 nm, 715 – 735 nm ve >755 nm

Kılıf sıvısı

Akış sitometrisi kalibrasyon boncukları

Boyama İşlemi

NUMUNE HAZIRLIĞI 

  1. DURAClone RE CLB Antikor Panelinin bir tüpüne 300 μL tam kan ekleyin.

  2. 6-8 saniye boyunca yüksek hızda vorteksleyin ve 18 ila 25 °C’de 15 dakika boyunca inkübe edin. Işıktan koruyun.

  3. 3 mL VersaLyse Fix-and-Lyse Karışımı ekleyin. 1-3 saniye boyunca yüksek hızda vorteksleyin ve 18 ila 25 °C’de 15 dakika boyunca inkübe edin. Işıktan koruyun.

  4. Tüpü 5 dakika boyunca 150 x g’de santrifüjleyin; üst fazı aspire edin. Peleti ayırmak için hafifçe vurun.

  5. 3 mL 1X PBS ekleyin; 5 dakika boyunca 150 x g’de santrifüjleyin. Üst fazı aspire edin.

  6. Hücreleri 500 μL 1X PBS/Fiksasyon çözeltisinde yeniden süspanse edin.

  7. Numune, artık edinme için hazırdır. FS parametresindeki ayırıcıyı lenfositlerin edinmenin dışında bırakılmayacağını garanti etmek için yeterince düşük bir değere ayarlayın.

TELAFİ AYARLAMASI

  1. Kompenzasyon Kitindeki tek renkli tüplerin her birine 100 μL tam kan ekleyin. Tüm tüpler aynı torbadan olmalıdır.

  2. Aşağıdaki kompenzasyon tüplerine bir damla pozitif VersaComp Antikor Yakalama Boncuğu ekleyin:

    • CD79b-PC5.5

  3. Numune Hazırlığı işlemindeki 2-7. adımları izleyin.

  4. Kompenzasyon ayarı için standart işlemleri ve cihaz üreticisinin talimatlarını izleyin.

Analysis (Analiz)


  1. Olası tekrarları ortadan kaldırmak için FS INT ile FS TOF karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği ve bir tekli geçit oluşturun (SFS TOF'ta daha yüksek değerlerle tanımlanır).

  2. CD45-Krome Orange ile SSC karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve tekli geçit uygulayın. CD45+ lenfositlerini kapsayacak bir bölge oluşturun.

  3. CD19-PC7 ile CD81-FITC karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve düşük SSC geçidi uygulayın. Agregatların dışarıda tutulduğu bir bölge çizin (otofloresanssız/agregatsız).

  4. CD19-PC7 ile SSC karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve adım 5’te (otofloresans/agregatlar olmadan) geçit uygulayın. CD19+ hücrelerinde geçit oluşturmak için bir bölge çizin.

  5. CD19-PC7 ile ROR1-PE karşılaştırması oluşturun ve CD19+ geçidini uygulayın. CD19+ROR1+ hücrelerini kapsayacak bir bölge oluşturun.

  6. CD5-APC ile CD43-APC-Alexa Flor 750 karşılaştırması oluşturun ve CD19+ROR1+ geçidini uygulayın. CD5+CD43+ hücrelerini kapsayacak bir bölge oluşturun.

  7. CD20-Pacific Blue ile CD81-FITC karşılaştırması oluşturun ve CD5+CD43+ geçidini uygulayın. CD20- CD81- hücrelerini kapsayacak bir bölge oluşturun.

  8. CD20-Pasifik Mavi ile CD79b-PC5.5 karşılaştırması oluşturun ve CD20- CD81- geçidini uygulayın. CD20- CD79b- hücrelerini kapsayacak bir bölge oluşturun.