DURAClone RE PC Protokolü

Bu protokol yalnızca referans amaçlıdır.  Yöntemi belirli araştırma ihtiyaçları için uyarlama yapılması gerekebilir.

Malzemeler

KİT KUTUSU İÇERİĞİ

DURAClone RE PC Antikor Paneli için 25 test

3 Kompenzasyon Kiti, her kit sekiz adet tek renkli tüp içerir:

  • CD4-FITC
  • CD4-PE
  • CD19-PC5.5
  • CD200-PC7
  • CD4-APC
  • CD56-APC-Alexa Flor 750
  • CD4-Pacific Blue
  • CD8-Krome Orange

NOT: Reaktif tüplerini buzdolabında saklamayın, tüplere dondurma/çözdürme işlemi uygulamayın. Özellikle edinme öncesinde numunenin/numunelerin işlenmesi ve inkübasyonu sırasında tüplerin ışığa maruz kalmasını en aza indirin.

GEREKLİ OLAN ANCAK SAĞLANMAYAN MALZEME

Antikoagülan, K2 EDTA veya K3 EDTA içeren kan toplama tüpü

Kalibre edilmiş pipetler

Vorteks mikser

VersaLyse Çözeltisi (Parça Numarası A09777)

IOTest 3 Fiksasyon Çözeltisi (Parça Numarası A07800).

VersaLyse Fix-and-Lyse Karışımı:

  • 1 mL of VersaLyse Çözeltisine 25 μL 10X IOTest 3 Fiksasyon Çözeltisi eklenerek her gün taze hazırlanır. Her numune ve kompenzasyon kontrolü için 1 mL gerekir.

Fosfat Tamponlu Salin, PBS (Parça Numarası 6603369 veya eşdeğeri)

  •  Kullanma Talimatına uygun olarak hazırlanmıştır.

1X PBS/Fiksatif:

  • 12,5 μL IOTest®3 10X Konsantresine 1 mL 1X PBS eklenerek her gün taze hazırlanır. Her numune ve kompenzasyon kontrolü için 500 μL gerekir.

VersaComp Antikor Yakalama Boncukları (Parça Numarası B22804)

Aşağıdaki lazerler ve dedektörlerle donatılmış akış sitometrisi:

  • FSC/SSC
  • 405 nm: 430 – 470 nm ve 530 – 570 nm
  • 488 nm: 504 – 545 nm, 560 – 600 nm, 605 – 635 nm, 680 – 710 nm ve >755 nm
  • 633 nm: 650 – 670 nm, 715 – 735 nm ve >755 nm

Kılıf sıvısı

Akış sitometrisi kalibrasyon boncukları

Boyama İşlemi

NUMUNE HAZIRLIĞI 

  1. Kemik iliği numunelerindeki toplam lökosit sayısını belirleyin.

  2. 3 ila 5 milyon lökosite eşdeğer numune hacmini boş bir tüpe aktarın.

  3. 100 μL kemik iliği hücresi başına 1 mL VersaLyse Fix-and-Lyse Karışımı ekleyin. Tüpü 1-3 saniye boyunca yüksek hızda vorteksleyin ve tüpü 18 ila 25 °C’de 15 dakika boyunca inkübe edin. Işıktan koruyun.

  4. Tüpü 5 dakika boyunca 300 x g’de santrifüjleyin; üst fazı aspire edin. Peleti ayırmak için hafifçe vurun.

  5. Peleti 100 μL PBS ile yeniden süspanse edin ve DURAClone RE PC Antikor Paneli tüpüne aktarın. 6-8 saniye boyunca yüksek hızda vorteksleyin ve 18 ila 25 °C’de 15 dakika boyunca inkübe edin. Işıktan koruyun.

  6. 3 mL 1X PBS ekleyin; 5 dakika boyunca 150 x g’de santrifüjleyin; üst fazı aspire edin.

  7. Hücreleri 500 μL 1X PBS/Fiksasyon çözeltisinde yeniden süspanse edin.

  8. Numune, edinme için hazırdır. FS parametresindeki ayırıcıyı lenfositlerin edinmenin dışında bırakılmayacağını garanti etmek için yeterince düşük bir değere ayarlayın.

TELAFİ AYARLAMASI

  1. Kompenzasyon Kitindeki tek renkli tüplerin her birine 100 μL tam kan ekleyin.  Tüm tüpler aynı torbadan olmalıdır.

  2. Aşağıdaki kompenzasyon tüplerine bir damla pozitif VersaComp Antikor Yakalama Boncuğu ekleyin:

    • CD200-PC7

  3. 6-8 saniye boyunca yüksek hızda vorteksleyin ve 18 ila 25 °C’de 15 dakika boyunca inkübe edin. Işıktan koruyun.

  4. 5. adımı atlayarak Numune Hazırlığı işlemindeki 3-8. adımları izleyin.

  5. Kompenzasyon ayarı için standart işlemleri ve cihaz üreticisinin talimatlarını izleyin.

Analysis (Analiz)

  1. Olası tekrarları ortadan kaldırmak için FS INT ile FS TOF karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği ve bir tekli geçit oluşturun (SFS TOF'ta daha yüksek değerlerle tanımlanır)

  2. FSC ile SSC karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve tekli geçit uygulayın. Kalıntıların (saçılım geçidi) hariç tutulduğu bir bölge ve düşük SSC lenfositlerinin dahil edildiği başka bir bölge oluşturun.

  3. CD27-PE ile CD81 FITC karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve saçılım geçidini uygulayın. Agregatların hariç tutulacağı bir bölge çizin.

  4. CD138-APC ile SSC karşılaştırmasını içeren bir nokta grafiği oluşturun adım 3’teki geçidi uygulayın. CD138+ SSC hücrelerinde geçit oluşturmak için bir bölge çizin.

  5. CD138-APC ile CD38-Pasifik Mavi karşılaştırması oluşturun ve CD138+ geçidini uygulayın. CD138+CD38+ hücrelerini kapsayacak bir bölge oluşturun.

  6. Düşük SSC lenfositlerini CD138+CD38+ geçidiyle karşılaştıran bir Boolean geçidi oluşturun ve aynısını aşağıdaki grafiklere uygulayın:

    • CD138-APC ile CD81-FITC karşılaştırması oluşturun.

    • CD138-APC ile CD27-PE karşılaştırması oluşturun.

    • CD138-APC ile CD19-PC5.5 karşılaştırması oluşturun.

    • CD138-APC ile CD200-PC7 karşılaştırması oluşturun.

    • CD138-APC ile CD56-APC-Alexa Flor 750 karşılaştırması oluşturun.

    • CD138-APC ile CD45-Krome Orange karşılaştırması oluşturun.

  7.  Normal lenfosit belirteçlerini (mavi, yukarıda) geçitlenen CD138+CD38+ hücrelerinin belirteçleriyle karşılaştırmak için yukarıdaki geçidi kullanın.