DURAClone SC Hematopoietik Protokol

Bu protokol yalnızca referans amaçlıdır.  Yöntemi belirli araştırma ihtiyaçları için uyarlama yapılması gerekebilir.

Malzemeler

KİT KUTUSU İÇERİĞİ

DURAClone SC Hematopoetik Kök Hücre Antikor Paneli için 25 test

2 Kompenzasyon Kiti, her kit sekiz adet tek renkli tüp içerir:

  • CD4-FITC
  • CD4-PE
  • CD34-ECD
  • CD10-PC7
  • CD45-APC-Alexa Flor 750
  • CD4-APC
  • CD4-Pacific Blue
  • CD8-Krome Orange

NOT: Reaktif tüplerini buzdolabında saklamayın, tüplere dondurma/çözdürme işlemi uygulamayın. Özellikle okuma öncesinde numunenin/numunelerin işlenmesi ve inkübasyonu sırasında tüplerin ışığa maruz kalmasını en aza indirin.

GEREKLİ OLAN ANCAK SAĞLANMAYAN MALZEME

Numune Toplama Tüpleri

Kalibre edilmiş pipetler

Vorteks mikser

VersaLyse Çözeltisi (Parça Numarası A09777)

IOTest 3 Fiksasyon Çözeltisi (Parça Numarası A07800)

Fosfat Tamponlu Salin, PBS (Parça Numarası 6603369 veya eşdeğeri)

  •  Kullanma Talimatına uygun olarak hazırlanmıştır.

1X PBS/Fiksatif:

  • 12,5 μL IOTest®3 10X Konsantresine 1 mL 1X PBS eklenerek her gün taze hazırlanır. Her numune ve kompenzasyon kontrolü için 500 μL gerekir.

VersaComp Antikor Yakalama Boncukları (Parça Numarası B22804)

Aşağıdaki lazerler ve dedektörlerle donatılmış akış sitometrisi:

  • FSC/SSC
  • 405 nm: 425 – 470 nm ve 530 – 570 nm
  • 488 nm: 505 – 790 nm
  • 633 nm: 650 – 790 nm

Kılıf sıvısı

Akış sitometrisi kalibrasyon boncukları

Boyama İşlemi

NUMUNE HAZIRLIĞI 

NOT: Numunede alyuvarlar varsa 3-4. adımları izleyin.  Yoksa bu adımlar atlanabilir.

  1. 100 μL numuneyi DURAClone SC Mezenkimal Antikor Panelinin bir tüpüne ekleyin.

  2. 6-8 saniye boyunca yüksek hızda vorteksleyin ve 18 ila 25 °C’de 15 dakika boyunca inkübe edin. Işıktan koruyun.

  3. 2 mL VersaLyse ekleyin. 6-8 saniye boyunca yüksek hızda vorteksleyin ve 18 ila 25 °C’de 10 dakika boyunca inkübe edin. Işıktan koruyun.

  4. Tüpü 5 dakika boyunca 150 x g’de santrifüjleyin; üst fazı aspire edin.

  5. 3 mL 1X PBS ekleyin; yüksek hızda 6-8 saniye vorteksleyin.

  6. Tüpü 5 dakika boyunca 150 x g’de santrifüjleyin; üst fazı aspire edin.

  7. Hücreleri 500 μL 1X PBS/Fiksasyon çözeltisinde yeniden süspanse edin.

  8. Numune analize hazırdır.

KOMPENZASYON AYARLAMASI

  1. Kompenzasyon Kitindeki tek renkli tüplerin her birine 100 μL tam kan ekleyin.  Tüm tüpler aynı torbadan olmalıdır.
  2. Aşağıdaki kompenzasyon tüplerine bir damla pozitif VersaComp Antikor Yakalama Boncuğu ekleyin:
  3. Numune Hazırlığı işlemindeki 2-8. adımları izleyin.
  4. Kompenzasyon ayarı için standart işlemleri ve cihaz üreticisinin talimatlarını izleyin.

 

Analysis (Analiz)

  1. FS INT ile FS TOF (uçuş zamanı) karşılaştırmasına ait bir grafik oluşturun ve grafiği geçitsiz bırakın. Düşük FS TOF değerlerine dayalı olarak tekli olayları kapsamak için bir bölge/geçit çizin, böylece tekrarlayan olayları analizin dışında tutun.

  2. FS INT ile SS INT karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve tekli geçit uygulayın. Kalıntıları analizin dışında bırakmak için yüksek ileri saçılım hücrelerini kapsamak üzere Saçılım olarak etiketlenmiş bir bölge çizin.

  3. CD45 ile SS INT karşılaştırmasına ait bir grafik oluşturun ve Saçılım kapısını uygulayın. Lökositleri kapsayacak şekilde CD45+ olarak etiketlenmiş bir bölge çizin.

  4. CD34 ile SS INT karşılaştırmasına ait bir grafik oluşturun ve CD45+ kapısını uygulayın. HSC'leri (Hematopoietik Kök Hücreler) ve HPC'leri (Hematopoietik Projenitör Hücreler) içeren CD34+ hücrelerini kapsayacak bir bölge/kapı çizin.

  5. CD45 ile SS INT karşılaştırmasına ait bir grafik oluşturun ve CD34+ geçidini uygulayın. HSC ve HPC içeren CD45dim kümelenmiş hücreleri kapsayacak bir bölge çizin.

  6. FS INT ile SS INT karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve CD45dim küme kapısını uygulayın. Düşük SSC'lerine göre HSC'leri/HPC'leri kapsayarak, böylece apoptotik hücreleri ve trombosit kümeleri hariç tutacak bir bölge çizin.

  7. CD45RA ile CD10 karşılaştırmasına ait bir grafik oluşturun ve HSC/HPC geçidini uygulayın. Sırasıyla CD10-CD45RA hücreleri ve CD45RA+ hücrelerini kapsayacak 2 bölge/geçit çizin.

  8. CD133 ile CD10 karşılaştırmasına ait bir grafik oluşturun ve CD45RA+ kapısını uygulayın. CD133- CD10+ BLP'leri (B-hücre Görünümlü Lenfoid Projenitörler), CD133+ CD10+ MLP'leri (Çoklu Lenfoid Öncüler), CD133+ CD10- GMP'leri (Granülosit ve Makrofaj Projenitörleri) ve LMPP'leri (Lenfoid ile Hazırlanmış Çoklu Potent GMP'ler) ve CD133- CD10- geç GMP’leri kapsayan bir kadran bölgesi/kapısı çizin.

  9. CD133 ile CD10 karşılaştırmasına ait bir grafik oluşturun ve CD10- CD45RA- kapısını uygulayın. Sırasıyla CD133- CD10- EMP'leri (Erythro-Myeloid Projenitörler) ve CD133+ CD10+ popülasyon MPP'lerini (Çoklu Potent Projenitörler) kapsayacak bir kadran bölgesi/kapısı çizin.

  10. CD90 ile CD38 karşılaştırmasına ait bir grafik oluşturun ve MPP kapısını uygulayın. CD38dim CD90+ HSC'leri kapsayacak bir kadran bölgesi/kapısı çizin.

  11. CD49f ile CD34 karşılaştırmasına ait bir grafik oluşturun ve CD38dim CD90+ kapısını uygulayın. CD133+ CD49f++'i kapsayacak bir bölge/kapı çizin