DURAClone SC Mezenkimal Protokolü

Bu protokol yalnızca referans amaçlıdır.  Yöntemi belirli araştırma ihtiyaçları için uyarlama yapılması gerekebilir.

Malzemeler

KİT KUTUSU İÇERİĞİ

DURAClone SC Mezenkimal Kök Hücre Antikor Paneli için 25 Test

3 Kompenzasyon Kiti, her kit sekiz adet tek renkli tüp içerir:

  • CD4-FITC
  • CD4-PE
  • CD34-ECD
  • CD146-PC5.5
  • CD105-PC7
  • CD45-APC-Alexa Flor 750
  • CD4-Pacific Blue
  • CD8-Krome Orange

NOT: Reaktif tüplerini buzdolabında saklamayın, tüplere dondurma/çözdürme işlemi uygulamayın. Özellikle edinme öncesinde numunenin/numunelerin işlenmesi ve inkübasyonu sırasında tüplerin ışığa maruz kalmasını en aza indirin.

GEREKLİ OLAN ANCAK SAĞLANMAYAN MALZEME

Numune Toplama Tüpleri

Kalibre edilmiş pipetler

Vorteks mikser

VersaLyse Çözeltisi (Parça Numarası A09777)

IOTest 3 Fiksasyon Çözeltisi (Parça Numarası A07800)

Fosfat Tamponlu Salin, PBS (Parça Numarası 6603369 veya eşdeğeri)

  •  Kullanma Talimatına uygun olarak hazırlanmıştır.

1X PBS/Fiksatif:

  • 12,5 μL IOTest®3 10X Konsantresine 1 mL 1X PBS eklenerek her gün taze hazırlanır. Her numune ve kompenzasyon kontrolü için 500 μL gerekir.

VersaComp Antikor Yakalama Boncukları (Parça Numarası B22804)

Aşağıdaki lazerler ve dedektörlerle donatılmış akış sitometrisi:

  • FSC/SSC
  • 405 nm: 430 – 470 nm ve 530 – 570 nm
  • 488 nm: 560 – 600 nm
  • 633 nm: 715 – 735 nm

Kılıf sıvısı

Akış sitometrisi kalibrasyon boncukları

Boyama İşlemi

NUMUNE HAZIRLIĞI 

NOT: Numunede alyuvarlar varsa 3-4. adımları izleyin.  Yoksa bu adımlar atlanabilir.

  1. 100 μL numuneyi DURAClone SC Mezenkimal Antikor Panelinin bir tüpüne ekleyin.

  2. 6-8 saniye boyunca yüksek hızda vorteksleyin ve 18 ila 25 °C’de 15 dakika boyunca inkübe edin. Işıktan koruyun.

  3. 2 Ml VersaLyse ekleyin. 6-8 saniye boyunca yüksek hızda vorteksleyin ve 18 ila 25 °C’de 10 dakika boyunca inkübe edin. Işıktan koruyun.

  4. Tüpü 5 dakika boyunca 150 x g’de santrifüjleyin; üst fazı aspire edin.

  5. 3 mL 1X PBS ekleyin; yüksek hızda 6-8 saniye vorteksleyin.

  6. Tüpü 5 dakika boyunca 150 x g’de santrifüjleyin; üst fazı aspire edin.

  7. Hücreleri 500 μL 1X PBS/Fiksasyon çözeltisinde yeniden süspanse edin.

  8. Numune analize hazırdır.

TELAFİ AYARLAMASI

  1. Kompenzasyon Kitindeki tek renkli tüplerin her birine 100 μL tam kan ekleyin.  Tüm tüpler aynı torbadan olmalıdır.

  2. Aşağıdaki kompenzasyon tüplerine bir damla pozitif VersaComp Antikor Yakalama Boncuğu ekleyin:

    • CD34-ECD
    • CD146-PC5.5
    • CD105-PC7

  3. Numune Hazırlığı işlemindeki 2-8. adımları izleyin.

  4. Kompenzasyon ayarı için standart işlemleri ve cihaz üreticisinin talimatlarını izleyin.

Analysis (Analiz)  

  1. FS INT ile FS TOF karşılaştırmasına ait geçitsiz bir nokta grafiği oluşturun. Düşük FS TOF değerlerine dayalı olarak tekli olayları kapsamak için bir bölge ekleyin, böylece tekrarlayan olayları analizin dışında tutun.

  2. CD45-APC-Alexa Flor 750 ile CD34-ECD karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve tekli geçit uygulayın. Lökositleri hariç tutmak için CD45+ fraksiyonunu, birikinti ve perisitleri içeren CD45- CD34- fraksiyonunu ve MSC’ye sahip endotelyal projenitör hücreleri içeren CD34+ fraksiyonunu kapsayacak bir bölge oluşturun.

  3. SS ile CD14/19-Krome Orange karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve tekli geçit uygulayın. MSC'leri içeren CD14/CD19 hücrelerini dahil edin.

  4. CD90-FITC ile CD146-PC5.5 karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve CD45-CD34- geçidi uygulayın. CD90+ ve CD90- perisitlerini tanımlamak için CD146+ hücrelerini dahil edin (örn. bir kadran geçidi kullanarak).

  5. CD31-Pasifik Mavi ile CD146-PC5.5 karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve CD34+ geçidini uygulayın. Endotelyal projenitör hücreleri tanımlamak için bir CD31+CD146+ geçidi ve MSC'leri içeren hücresel fraksiyonu kapsayacak bir CD31- CD146- geçidi oluşturun.

  6. CD73-PE ile CD90-FITC karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve CD31-CD146- geçidi uygulayın. MSC'leri içeren CD73+CD90+ fraksiyonunu dahil edin.

  7. CD105-PC7 ile CD90-FITC karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve CD73+CD90+ geçidi uygulayın. MSC'leri tanımlamak için CD105-CD90+ fraksiyonunu dahil edin.

  8. SS ile CD14/CD19-Krome Orange karşılaştırmasına ait bir nokta grafiği oluşturun ve MSC geçidine uygulayın. CD14- CD19- MSC'lere ait kısmı değerlendirmek için CD14/CD19-Krome Orange’a (3. adımda oluşturulur) bağlı bir geçit oluşturun.

  9. CD31, CD34, CD73, CD105, CD90, CD146 eksenlerini içeren bir radar grafiği oluşturun ve MSC'lerin izole bir şekilde kümelendiğini doğrulamak için boolean CD45neg geçidi (“CD45-CD34-” VEYA “CD34+”) uygulayın.